Anti-58K Golgi protein antibody [58K-9] - Golgi Marker (ab27043)

Al pie del mail, en color azul, encontrará la contestación del cliente a las sugerencias realizadas previamente por usted con respecto al no funcionamiento del anticuerpo AB27043 de Abcam (mouse moclonal, clone58-K9, to 58K Golgi protein-Golgi marker).
Quedo a la espera de la manera de proseguir.
Muchas gracias por tu pronta respuesta
Saludos,

ANSWER:

Muchas gracias por su respuesta.

Lamento mucho que las sugerencias enviadas no ayudaran a mejorar los resultados.

Siendo que el anticuerpo está aun en garantía, le puedo ofrecer las siguientes opciones:

Mandarle un lote diferente al enviado con anterioridad del mismo anticuerpo.
Mandarle otro anticuerpo contra la misma proteína, hay varias alternativas que pueden servirle, le adjunto el link para que las estudie y decida si le interesan:



http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=searchresults&search=58K%20Golgi&pt=1&sk=react&sv=21&sn=Human&l=3&fViewMore=1

Hacerle un vale sin fecha de caducidad para que canjee en una futura compra con nosotros.
Devolverle el importe íntegro invertido en el anticuerpo.



Espero pues vuestra respuesta para que me indiquéis como proceder para poderles ayudar a solucionar el problema.

Si tienen cualquier consulta adicional, no duden en contactarnos de nuevo.

Muchas gracias por su pronta respuesta. Es un placer saber que puedo escribir en castellano!!
Le enviaré estas sugerencias al cliente.
Nos mantenemos en contacto, nuevamente muchisimas gracias
Saludos,

ANSWER:

¡No hay de qué!

¡No dudes en contactarnos en castellano siempre que lo necesitéis!

Espero que las sugerencias puedan ayudar al cliente. En caso contrario, por favor, no dudes en contactarnos de nuevo.

Que pases un buen día.

Escribo para reclamar el funcionamiento del anticuerpo ab27043. Lo estoy usando en WB, y no consigo ver ninguna banda. Adjunto vera un documento que recoge toda la información del protocolo y el método de detección.
Espero su respuesta al respecto para que me ayude a resolver el problema.
Gracias por su ayuda.
Atentamente,

ANSWER:

Te agradezco muchísimo que nos hayas enviado los detalles relativos al protocolo seguido con el anticuerpo, y lamento las molestias que el fallo del mismo pueda causarles.

Después de estudiar el protocolo enviado, me gustaría haceros una serie de sugerencias, en un intento por mejorar el resultado del anticuerpo. En cualquier caso, todos nuestros productos tienen una garantía (Abpromise) de 6 meses, por la cual si un anticuerpo no se comporta tal y como se especifica en la datasheet, le enviaremos un reemplazo del mismo, un anticuerpo alternativo, o simplemente un reembolso o vale por el importe del mismo.

Las recomendaciones que me gustaría hacer al protocolo son las siguientes:

Este anticuerpo se ha validad en varias especies, entre ella humano y rata. Sin embargo, tal y como puede verse en la datasheet del mismo, no hay evidencias de su funcionamiento en ratón, por lo que no puedo asegurarte su funcionamiento en esta especie.
Para llevar a cabo el lisado del la muestra, se requieren condiciones reductoras desnaturalizantes, y para asegurarlas, es aconsejable usar RIPA como buffer de lysis. Os adjunto el link del modo de preparación de este buffer:




También es aconsejable, para evitar degradación de la proteína, añadir al buffer de lisis inhibidores de proteasa.

Para facilitar la reducción de la proteína, SDS que mencionáis es un buen agente, pero se recomienda además hervir la muestra durante unos 10 minutos.
Respecto a la carga de muestra por calle, os sugeriría cargar alrededor de 20-30 ug.
Al no observar ninguna banda en el blot, es posible que no se hayan transferido correctamente desde el gel a la membrana las proteínas, por eso es muy importante chequear que la transferencia se ha realizado con éxito, usando reactivos como Ponceau-S o Coomassie.
Siempre recomendamos el uso de controles positivos para ayudar a dilucidar la procedencia del problema, si es debida al anticuerpo, o al método en sí mismo. Para este caso, la datasheet aconseja usar hígado de rata como control positivo.
También sería útil probar otro agente de bloqueo, como 5% BSA, que al ser menos fuerte que la leche, es posible que permita la visualización de las bandas.
Por último, también recomendaría disminuir la concentración tanto del primario como del secundario. Probad 1/200 para el primario y 1/5000 con el secundario.
Respecto a los lavados, como no se menciona nada en el protocolo, la pauta general que solemos usar en el laboratorio es llevar a cabo 4 lavados de 10 minutos con TBST después de cada incubación.



Por si pudiera resultaros útil, os incluyo también el link al protocolo general de Western Blot que tenemos en nuestra web.

http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11375

Espero que estas sugerencias ayuden a mejorar los resultados del anticuerpo. En caso contrario, por favor, no dudéis en volver a contactarnos y estaremos encantados de seguir ayudándoos.

Thank you for your reply.

The cells I am using are NE-4C mouse neuroectodermal stem cells.
The antibody does not seem to be localizing to the golgi and unspecific staining
appears to be nuclear (image attached).

Following 4% PFA fixation, I've tried blocking in PBS with 0.5% BSA fraction V
for 30 min in room temperature. What incubation conditions (time and
temperature) do you suggest for 3% milk blocking?

I have tried 1:100 and 1:200 dilutions for the primary antibody in blocking
buffer, I incubated it for 1 hour at room temperature.

For the secondary antibody, I have tried either texas red or FITC in
dilutions or 1:300, 1:200, and 1:100, in blocking buffer. I incubated the 2nd
antibody for 1 hour in the dark at room temperature. I have used the same
secondary antibodies to localize other compartments and other specific receptor
proteins without a problem.

Alternatively, following 1:1 methanol:acetone fixation, I have used 2% normal
serum + PBS-T for blocking, primary, and secondary antibody incubation.
I appreciate your help.

ANSWER:

Thank you for confirming the additional information.


We haven't yet tested this antibody with mouse, so we are unsure how or if it will work in this species. There is a good chance for cross-reactivity since it works in rat, but we haven't tested, nor do we guarantee, this antibody in mouse. Would you be able to run a positive control with rat or human cells?


You can try 3% blocking for 1 hr at RT to see if that helps. Would you be able to also try the primary at 10 ug/ml and incubating this overnight at 4C?


Please let me know if these suggestions improve your results. I would be really interested to hear if you get a signal with a tested species sample. I look forward to your reply.

This customer has highly interested in ab1299 (Anti-GM130 antibody [NN 2C10/1] - Golgi Marker) and ab27043 (Anti-58K Golgi protein antibody [58K-9] - Golgi Marker) which can be a marker of Golgi, he wants to conduct IHC-P with yeast sample. According to the online datasheet, these antibodies didn’t test in yeast sample. Therefore, he wants to ask for your help to choice one suitable antibody for him, could you please offer any suggestion or selection to him? Could you please help this customer to solve the problem? Thanks for your assistance. Best regards

ANSWER:

Thank you for your inquiry.

Unfortunately, we do not have antibodies against 58K Golgi protein and GM130 available in our catalog that can be used for Yeast. I would like to recommend checking the Biocompare website which has an excellent antibody search facility that includes many suppliers.

The links are: www.biocompare.com http://www.biocompare.com/ProductCategories/2045/Antibodies.html

I hope this information is nevertheless helpful to you. Please do not hesitate to contact me if you have any further questions in this regard.