Anti-BMP4 antibody [66119.11] (ab6296)

ich hoffe die ausgefüllte Anlage ist hilfreich. Die schlechten Blots habe ich gar nicht eingescannt, Könnte es aber bei Bedarf noch machen. Bei den angefügten Western ist die quantitative Auswertung durch den starken Hintergrund nicht möglich. Ich hoffe Sie können mir weiterhelfen.

1) Abcam product code ab 6296

2) Abcam order reference number or product batch number ??

3) Description of the problem Background is very high, Bands are not clear,

4) Sample preparation:
Type of sample (whole cell lysates, fraction, recombinant protein…): lysate from kidney (mouse)
Lysis buffer 50nm Tris, 2%SDS, 1mM Na2VO4
Protease inhibitors:Complete Mini from Roche
Phosphatase inhibitors
Reducing agent
Boiling for ≥5 min? yes/no Yes
Protein loaded ug/lane or cells/lane 25 µg
Positive control no
Negative control no

5) Percentage of gel 12,5,%
Type of membrane PVDF
Protein transfer verified yes
Blocking agent and concentration 5% powdered milk/1%BSA
Blocking time 2 hours
Blocking temperature roomtemperature

6) Primary antibody (If more than one was used, describe in “additional notes”) :
Concentration or dilution 1:250
Diluent buffer 5% powdered milk/1% BSA
Incubation time over Night
Incubation temperature: 4°C

7) Secondary antibody:
anti-mouse IgG-HRP Horse

Species: horse
Reacts against: mouse IgG
Concentration or dilution 1:1000
Diluent buffer 5% powdered milk/1% BSA
Incubation time 1 hour
Incubation temperature: roomtemperature
Fluorochrome or enzyme conjugate:HRP

8) Washing after primary and secondary antibodies:
Buffer TBS/ 0,1% Tween
Number of washes 3x-5x

9)Detection method Luminol, no change to former detections
10) How many times have you run this staining? > 30
Do you obtain the same results every time? With the last Lot of Antibody yes, with former AB not
What steps have you altered to try and optimize the use of this antibody? Increase washing

ANSWER:

1. Bleiben Sie bei einem Blockmittel während des Experimentes, also entweder Milch oder BSA, aber eben keine Kombination. Desweiteren scheinen monoklonale Antikörper bessere Ergebnisse mit 3% BSA zu liefern als mit Milch (siehe Anhang).

2. Es ist nicht ganz ersichtlich, ob Sie während der Antikörper- Inkubationen ein Detergenz wie Tween verwenden. Falls es nicht der Fall sein sollte, möchte ich dies Ihnen raten: Dadurch erleichtern Sie das Lössen des Antikörpers in der Lösung, und es bildet sich keine blockierende Proteinschicht. Desweiteren kann man bei einer hohen Blockmittelkonzentration noch beobachten, dass sich die geblotteten Proteine ablösen, und es daher zu einer Signalverminderung kommen kann (J. Immunol. Meth. 122:129-135, 1989).

3. Haben Sie den Sekundär- Antikörper in letzter Zeit mit einem anderen Primär- Antikörper verwendet? Haben Sie einmal eine "Non-Primary" Kontrolle durchführt? Nur für den Fall, dass der Zweitantikörper nicht so funktioniert, wie er sollte.

herzlichen Dank für die Ersatzlieferung des BMP4 Antikörpers. Er ist heute angekommen, war allerdings nicht mehr gekühlt, der Kühlakku hatte Raumtemperatur. Funktioniert er dann trotzdem noch?

ANSWER:

Das sollte eigentlich kein Problem darstellen: wir versenden unsere Produkte ja z. B. auch nach Australien oder Thailand, und da sind die auch schon ein mal bis zu 7 Tagen unterwegs, ohne das die Qualität leidet.

Wir haben dazu auch auch schon einmal Versuche hier bei uns im Haus laufen lassen, und festgestellt, dass die meisten Antikörper so robust sind, dass sie sogar nach einen Monat (!) bei Raumtemperatur zuverlässige Ergebnisse liefern.

Falls Sie bei Ihren Experimenten auf Schwierigkeiten stoßen, melden Sie sich bitte wieder bei uns.

Black blot! Old lots always worked.
Snail abs availible?

ANSWER:

Es tut mir leid, dass Sie Probleme mit diesem Antikörper hatten. Wie am Telefon besprochen habe ich eine kostenlose Ersatzlieferung für Sie in Auftrag gegeben. Sie hat die Referenznummer XXXXX und sollte ab dem 23. Mai bei Ihnen ankommen.

Als SNAIL-Ersatzprodukt würde ich den ab82846 Anti-SNAIL antibody empfehlen, da er der einzige von unseren Antikörpern ist, der in meinen Augen schlüssige Ergebnisse mit dem endogenen Protein liefert, auch wenn der Blot nicht "sauber" ist.

Thanks. I'm using the Human Osteosarcoma Cell Line (SaOS-2). Secondary antibody is working as I used the same with other primary antibody which fits to the same. But still I'll give a try by increasing the primary conc, and no primary control too. Thanks once again.

ANSWER:

The human cell line that your are using should be fine for this antibody. Please let me know the results of the no primary control and also if increasing the concentration of the primary works out.

What application are you using this antibody in? >>Western Blotting

Lot number: >>18797

Purchase Order Number or preferably Abcam Order Number: >> #25442 (dated Oct 13,2003)

Description of the problem: (no signal, high background, non-specific signal etc). >>First Time I used the dilutions of 1/50,000 in Primary but didn't get any detectable signal. Then to optimize it I made the Primary Antibody Dilutions of 1/1,000 and 1/5,000 and the Secondary as 1/50,000 , 1/150,000 and 1/250,000 dilutions. Tried the 2x3 = 6 combinations in strips. I got some multiple bands in the Primary 1/1000 and Secondary 1/50,000 dilutions combination. Rest of them didn't gave any signal. Do you have any BMP-4 as polyclonal antibody?

Sample (Species/Cell extract/Nuclear extract/Purified protein/ Recombinant protein etc) >>Cell lysate Proteins

Sample preparation >> samples are prepared using Bio-Rad Ready Gel 4-20 % Gradient Tris-HCl Gel

Blocking Conditions (Buffer/Time period, Blocking agent etc) >> 1 hr in 5% milk , 0.1% tween 20 in PBS

Primary Antibody (Manufacturer/Species/Diluent/Dilution/ Incubation time, Wash step) >> Abcam BMP-4 Secondary Antibody (Manufacturer/Species/Diluent/Dilution/ Incubation time, Wash step) >>Pierce Technology (www.piercenet.com) Goat Anti-mouse # 1858413 , Prepared in Blocking solution and incubated for 1 hr at room temp.

Detection method >> UVP Chemi system. Used the Pierce Super Signal West Dura Substrate (# 34075) to detect.

Positive and negative controls used. (Please specify) >>None

Optimization attempts (problem solving) >> after optimization of the dilutions I tried with the full experiment. Ended with bands that were not in the range(size wise). Have you run a "No primary" control? >> Not run

How many times have you tried this assay? >> 3 times .

What steps have you altered? >> Used the diff dilutions. >> Tried different incubation methods.

Thanks for taking time to troubleshoot.

Regards, Vikas Saini UIC Bioengineering

ANSWER:

Thank you for the details of your protocol.

First, I suggest using a positive control. What species are your samples from? Ab6296 was tested on human recombinant purified BMP-4 (50 ng)at a concentration of 1-2 ug/ml.

Second, is your secondary antibody working? Try a no primary control to test this.

In addition, you may want to increase the concentration more.

At this time we don't have a polyclonal BMP-4 antibody.

Please let me know if you have any more questions or concerns.