Anti-FAAH1 antibody (ab54615)

Bonjour,
Merci pour votre réponse. En effet, nous utilisons des anti protéases pour nos échantillons de muscle squelettique. En quoi cela peut modifier les résultats dans ce sens?
Nous allons essayer l’anticorps secondaire simplement mais à priori pour l’avoir utilisé avec d’autres anticorps, nous n’avons jamais eu de problème.
Merci beaucoup pour votre aide,
Très cordialement,

ANSWER:

Ma collègue étant actuellement absente, c'est pourquoi je vous transmets moi-même la réponse que nous avons obtenue du laboratoire où est produit l'anticorps ab54615 :

"This antibody has been tested in FAAH recombinant protein for WB assay, and it is specific to FAAH protein. Then we further tested it in Western blot for rat brain, PC-12, A-431 and NIH/3T3 lysate and could get a band around 60 KDa as we expect. I have checked the original data, and we have not tested the antibody on other samples, so I am sorry that I could not share the related data with you. But I searched the information of FAAH protein, and I found that FAAH protein is a membrane protein which has transmembrane domain. In some cases this would affect the MW of protein. (http://www.uniprot.org/uniprot/O00519)"

J'espère que ces informations supplémentairesvous seront utiles. N'hésitez pas à nous contacter de nouveau et partager les résultats obtenus avec le secondaire seul. Cecontrolepermettra peut-être d'y voir un peu plus clair.

Je me permets de vous contacter à propos de 1 anticorps acheté chez ABCAM: FAAH1 (ab54615).
Pour cet anticorps nous travaillons sur 20ug de protéines provenant d’un échantillon de muscle extrait au RIPA.
L’électrophorèse est réalisé sur un gel SDS-acrylamide
Après transfert nous bloquons la membrane de nitrocellulose au Lait 5% dans TBS tween 0,05% pendant 2heures
L’anticorps est mis à une concentration de 1/1000ième
Incubation toute la nuit
3 lavages au TBS tween 0,05%
Incubation de l’anticorps secondaire anti souris au 1/5000ième.
Malheureusement comme vous pouvez le voir sur l’image, les deux échantillons musculaires montrent des bandes à 50kDa. Sur l’échantillon de droite, nous avons mis du cortex visuel. Sur ce dernier la bande se situe à environ à 60kDa.
Pourriez vous me dire comment vous interprétez ces résultats?

ANSWER:

Merci pour votre émail.

J'ai regardé votre protocole et le résultat. L'explication plus logique me semble qu'il existe des isoformes/modifications post-traductionnelles différentes dans le muscle et dans le cerveau. J'ai donc cherché dans la littérature pour trouver une évidence de cette hypothèse. Malheureusement je n'en ai pas trouvé. Même sur SwissProt il n'a pas des références par rapport à des isoformes. http://www.uniprot.org/uniprot/O00519

Pour mieux comprendre le problème et exclure des autres possibilités, j'aimera bien confirmer les deux points suivants avec vous:

1.) Est-ce que vous avez utilisé du tissue de muscle squelettique? Est-ce que vous avez ajouté des inhibiteurs de protéase dans le lysat?

2.) Est-ce que l'anticorps secondaire tout seule vous donne aucune bande? Effectivement, l'anticorps secondaire pourrait éventuellement reconnaitre des immunoglobulines endogènes dans le lysat de muscle. La chaine lourde correspond à environ 50kD. Si vous avez pas fait ce test, je peux vous recommander de tester l'anticorps secondaire séparément, sans anticorps primaire.

Je me réjouis de votre réponse et j'espère que nous allons pouvoir trouver une explication de ces bandes ensemble.