Anti-Fibroblast activation protein, alpha antibody - Spacer region (ab28245)

entsprechend ihrer unten angeführten Vorschläge, haben wir jetzt den FAP alpha-Antikörper ab28245 erneut getestet.
Allerdings konnten wir trotz der Optimierungsschritte leider keine Besserung erzielen. Zur Veranschaulichung habe ich Ihnen die Blots beigefügt.


...

Nachdem wir nach diesen Schritten davon ausgehen müssen, dass der Antikörper nicht zum gewünschten Ergebnis führt, wäre ich sehr dankbar wenn Sie uns, wenn möglich, die Kosten zurück erstatten können.

Vielen Dank und beste Grüße

ANSWER:

Vielen Dank für Ihre Antwort. Es tut mir leid zu hören, dass unsere Vorschläge in diesem Fall nicht zu einer Verbesserung Ihrer Ergebnisse geführt haben. Ich weiß, dass Sie viel Zeit für diese Experimente verwendet haben, und möchte mich für Ihre Kooperation herzlich bedanken.

Die Referenznummer Ihrer Gutschrift ist x.

Es tut mir leid, dass der Antikörper nicht so funktioniert hat, wie auf dem Datenblatt angegeben. Ich habe unsere Finanzabteilung beauftragt, eine Gutschrift für Sie auszustellen. Sie können diese Gutschrift auf folgende Weise verwenden:

(1) Gegen die Rechnung dieses Antikörpers verwenden falls diese noch nicht bezahlt wurde
(2) Aufbewahren und gegen eine zukünftige Rechnung verwenden
(3) Wir stellen Ihne gerne eine komplette Rückerstattung aus, wenn keine offenen Rechnungen mehr ausstehen

Um eine Rückerstattung des Kaufpreises zu erhalten oder um zu bestätigen wie Sie diese Gutschrift benutzen möchten, möchte ich Sie bitten, sich mit unserer Finanzabteilung in Verbindung zu setzen. Sie können unsere Finanzabteilung per Email unter der Addresse creditcontrol@abcam.com erreichen. Bitte geben Sie die Referenznummer Ihrer Gutschrift immer mit an.

Die Referenznummer ist für Ihre Unterlagen bestimmt. Wir schicken Ihnen die eigentliche Gutschrift per Post oder eMail zu. Sie enthält auch die Gutschriftnummer, die mit dem Buchstaben CGB beginnt.

Ich hoffe, dass Sie trotz dieser schlechten Erfahrung weiterhin Kunde bei uns bleiben. Bitte zögern Sie nicht, sich wieder an uns zu wenden, falls Sie weitere Fragen haben.

Hi, I want to buy Fibroblast activation protein antibody, and I saw there are 4 products on your website. Ab28243 Catalytic domain Ab28246 Catalytic insert Ab28245 Spacer Ab28244 Stalk I want to do immunofluorescence in rat fibroblast to see if my treatment can activate fibroblast or not. I want to use FAP as a marker for the activated fibroblast. So which antibody do you suggest? Thanks!

ANSWER:

Thank you for contacting Abcam.

I would recommend using ab28244 or ab28246 as each of these is guaranteed to work in IF on rat tissues under our Abpromise.

The immunogen for ab28244 Fibroblast activation protein, alpha antibody starts at the beginning of the stalk region.This region starts at amino acid 30 of the 760 amino acid sequence of human FAP-alpha, and follows the transmembrane domain. Cleavage of the stalk region releases the shed form of FAP-alpha.

ab28246(Fibroblast activation protein, alpha antibody - Catalytic insert) will recognize the 759 amino acid sequence of human FAP-alpha which has an insert in the catalytic domain.

These products are covered by our Abpromise guarantee. If you experience any issues with these products we offer scientific support, replacement or refund under our Abpromise guarantee, for a period of 6 months from purchase, if used according to specifications listed on our datasheet.

Nachdem ich mehrmals Zustellungsprobleme hatte, schicke ich Ihnen diese Mail zunächst ohne die Blots.

ANSWER:

Vielen Dank für Ihre Anfrage und dafür, dass Sie sich die Zeit genommen haben, unseren Fragebogen auszufüllen - und zu schicken: Gestern sind beide emails (mit und ohne Positivkontrollen) angekommen.

Es tut mir leid, dass Sie Probleme mit unserem FAP alpha-Antikörper ab28245 hatten.

Das Protokoll, das Sie verwendet haben, ist eigentlich absolut in Ordnung. Und gerade bei dem unspezifischen Hintergrund (alle Banden unter 80 kDa) wäre es auch mein erster Versuch gewesen, die verschiedenen Blockierungsmittel auszutesten. Da zumindest in den NAF- und CAF-Proben (lane 3+4) jedoch zwei Banden zwischen 83 und 175 kDa zu sehen sind, von denen eine FAP alpha sein könnte (erwartet aufgrund starker N-Glykosylierung: 110-120 kDa), wäre es meines Erachtens noch einen Versuch wert, einen weiteren Optimierungsschritt zu testen. Daher würde ich folgendes vorschlagen:

den primären Antikörper in einer höheren Verdünnung (z.B. 1:5000 wie für Chemilumineszenzdetektion) einzusetzen das Blockierungsmittel zu nehmen, bei dem Sie bisher die schwächste Hintergrundfärbung erhalten haben. (Bei uns im Labor wird routinemaessig mit 5% BSA geblockt, weil dies aufgrund einer ebenmäßigen Blockierung für die meisten Antikörper ein besseres Ergebnis zeigt.) jeweils einen weiteren Waschschritt einzufügen Außerdem erscheint mir eine Beladung mit 100 µg etwas hoch, denn normalerweise sind 30-50 µg ausreichend. Falls Sie jedoch das Gel nicht neu fahren, sondern den Blot nur strippen und erneut inkubieren, sind 100 µg in Ordnung. Außerdem weiß ich nicht, ob Sie vielleicht noch weitere Proteine detektieren möchten, die schwächer exprimiert sind, so dass eine Beladung mit 100 µg doch angemessen sein könnte.

Mit diesen Schritten würde ich eine Verstärkung der spezifischen Bande(n) und eine Reduzierung der unspezifischen Banden erwarten. Falls es aber zu keiner deutlichen Verbesserung der Ergebnisse kommen sollte, spricht alles dafür, dass der Antikörper das Problem ist. In diesem Fall kann ich Ihnen gerne einen kostenlosen Ersatz (ggf. mit einem anderen FAP alpha-Antikörper) senden oder eine Rückerstattung ausstellen.

Bitte lassen Sie mich wissen, ob ich Ihnen helfen konnte und zögern Sie nicht, sich wieder bei uns zu melden, falls Sie weitere Fragen haben.

erwartet bei 88 kDa, sehen aber auch viele andere Banden. Probiert: verschiedene Fibroblastenzelllinien, verschiedene Blockingpuffer (BSA, Milch, Roche), SekAK ist ok, 1:1000.

ANSWER:

Vielen Dank für Ihren Anruf. Es tut mir leid zu hören, dass Sie Probleme mit diesem Anti-Fibroblast activation protein-Antikörper haben. Wie am Telefon besprochen, habe ich unseren Fragebogen als Word-Dokument an diese E-Mail angehängt. Durch das Ausfüllen des Fragebogens erhalten wir alle nötigen Informationen über Ihre Proben und Ihr Protokoll. Sobald Sie dieses Formular an uns zurückgeschickt haben, werden wir uns Ihr Protokoll ansehen und möglichst Veränderungsvorschläge machen, die Ihre Ergebnisse verbessern werden. Falls sich herausstellt, dass der Antikörper nicht so funktioniert, wie auf dem Datenblatt beschrieben und er innerhalb der letzten sechs Monate gekauft wurde, werden wir Ihnen gerne einen Ersatz oder eine Gutschrift schicken. Ich freue mich, bald wieder von Ihnen zu hören.

Many thanks for your reply. However, I am confused about the difference from the FAP: stalk region and FAP: spacer region. In other words, If I am prepare for Flow Cytometry using FAP,

which one is suitable? FAP alpha:stalk region, just according to the application information.I am looking forward to your reply.

Best regards

ANSWER:

Thank you for your reply.

I can confirm that only ab28244 (Anti-Fibroblast activation protein, alpha antibody - Stalk region) is tested and guaranteed for flow cytometry and I therefore recommend this antibody for your experiments.

Please find a publication that used this antibody in flow cytometry on the datasheet: datasheet=28244.http://www.abcam.com/index.html?datasheet=28244 http://www.abcam.com/index.html?datasheet=28244.

The descriptive terms for these antibodies are based on comparison with the dipeptidyl peptidase family, especially DPP-4.

FAP-alpha starts with a short cytoplasmic domain followed by a transmembrane domain.

The stalk region, which starts at amino acid 30 of the 760 amino acid sequence of human FAP-alpha, follows the transmembrane domain and is extracellular.

Cleavage of the stalk region releases the shed form of FAP-alpha. RP1-FAP-alpha (ab28244 Fibroblast activation protein, alpha antibody - Stalk region) starts at the beginning of the stalk region.

This antibody recognizes the Stalk Region of both long isoforms of Fibroblast activation protein-alpha.

Between the stalk region and the catalytic domain is the spacer region. RP2-FAP-alpha ab28245 (Fibroblast activation protein, alpha antibody - Spacer region) is in the middle of this spacer region, it starts shortly after amino acid 250.

I hope this will be helpful to you.

Please fell for to contact me again in case you have further questions.