Anti-SETD7 antibody [s4E5] - ChIP Grade (ab14820)

Vielen Dank für ihre Vorschläge zur Veränderung der Protokolle. Gerne erkläre ich Ihnen die genannten Punkte genauer.

1.) Das rekombinante Protein ist definitiv full lenght (mus musculus).
2.) Für den Western Blot wurden 50 µg protein lysate genutzt. Für das endogene Protein liegen uns nur Daten zur RNA vor, diese ist hoch-konzentriert vorhanden (nachgewiesen mit ISH und rt-qPCR). Das rekombinante Protein ist definitiv in nachweisbarer Konzentration vorhanden, was durch einen integrierten Myc-tag gezeigt werden konnte.
3.) BSA als Blockierungsmittel beim Westernblot habe ich in der Zwischenzeit versucht aber es hat leider nicht besser funktioniert.
4.) Die Cryo-Schnitte wurden nicht extra in 4% Pfa fixiert, sondern nur die Proben vor dem Einbetten. Beim Vergleich von Färbungen mit und ohne vorherigem Antigen Retrieval (sowohl SDS als auch Citrat Puffer) konnte kein Unterschied festgestellt werden.

Falls Sie weitere Vorschläge haben, die mir helfen können, mit diesem Antikörper zu arbeiten, lassen Sie es mich bitte wissen. Ansonsten würde ich Sie bitten, uns den Antikörper zu ersetzen.

Unabhängig davon, bin ich zur Zeit auf der Suche nach einem alternativen Antikörper für Setd7. Eventuell können Sie mir einen Ihrer anderen 8 Setd7-Antikörper empfehlen? Mich interessiert dabei vor allem, ob einer dieser AK erfolgreich im Frosch oder Fisch für IP und WB (im Idealfall auch IF in der Maus) verwendet wurde.

Mit freundlichen Grüßen,

ANSWER:

Vielen Dank für Ihre Antwort.

Es tut mir leid, dass die Vorschläge das Problem nicht lösen konnten. Ich muss daraus schliessen, dass das Röhrchen welches Sie bekommen haben beschädigt ist. Es tut uns sehr leid. Wir senden Ihnen natürlich gerne einen Ersatz. Sie können wählen, ob Sie als Ersatz ein neues Röhrchen des ab14820 hätten, ein Röhrchen eines alternativen Antikörpers oder eine Gutschrift/Rückerstattung. Können Sie uns bitte hierzu auch die originale Bestellnummer des ab14820 geben? Falls Sie die Nummer nicht haben, können Sie uns das Datum der Bestellung sowie den Namen der Person die den ab14820 bestellt hat geben? Vielen Dank.

Leider haben wir zur Zeit jedoch keinen Setd7 Antikörper in unserem Katalog, der unseres Wissens nachauf Frosch oder Fischgewebe getestet wurde. Der ab124708 ist der einzige Antikörper gegen Setd7, der schon in IP und WB getestet wurde. Ich habe nun das Labor angefragt, ob die Immunogensequenz gewisse Homologie mit der Proteinsequenz von Setd7 von Fisch und Frosch hat. Ich werde mich melden sobald ich eine Antwort habe.

Unabhängig von der Ersatzsendung, können wir Ihnen dann auch ein Testangebot machen, falls Sie einen anderen Setd7 Antikörper von uns auf Fisch und Frosch testen wollen. Details eines solchen Angebots sind hier zu finden: http://www.abcam.com/collaborationdiscount

Ich freue mich wieder von Ihnen zu hören.

Anbei finden sie die ausgefüllten Fragebögen zu WB und IHC von ab14820.

mfg,

ANSWER:

Vielen Dank für Ihre Email und dafür, dass Sie sich die Zeit genommen haben, unseren Fragebogen auszufüllen.

Es tut mir leid, dass Sie Probleme mit unserem Antikörper hatten.

Um die Ursache des Problems herauszufinden undzu lösen,möchte ich die folgenden Vorschläge zu Veränderung Ihres Protokolls machen. Ich wäre Ihnen auch dankbar, wenn Sie gewisse Punkte genauer erklären könnten.

1.) Können Sie bitte bestätigen, dass das rekombinantefull length Protein benutzt wurde?

2.) Wissen Sie, ob in den Western blot lysaten genug rekombinantes oder endogenes Protein vorhanden ist, sodass es detektiert werden kann?

3.) Ich kann Ihnen auch empfehlen, BSA als Blockierungsmittel für den Western blot auszuprobieren. In der Tat, kann ein anderer Blockierungspuffer das Resultat signifikant verändern. Als Beispiel dafür, hat es ein Bild auf dem Datenblatt von ab9385 http://www.abcam.com/index.html?datasheet=9385 (or use the following: http://www.abcam.com/index.html?datasheet=9385).

4.) Für die Immunhistochemie, kann ich Ihnen emfpehlen die gefrorenen Schnitte nur 10 Minuten mit 4%PFA zu fixieren. Dies ist genug für normale Gefrierschnitte. In der Tat kann eine zu lange Fixierung das Gewebe so verändern, dass es nicht mehr gefärbt werden kann. Wenn 10 Minuten fixiert wird, brauchen Sie auch keine Demaskierung. Sie können danngleich mit der Permeabilisierung fortfahren. Bitte lassen Sie mich wissen, falls ich Ihr Protokoll missverstanden habe.

Wie schon gesagt, falls wir das Problem nicht lösen können, werden wir Ihnen diesen Antikörper ersetzen.

Ich freue mich wiedervon Ihnen zu hören.

As you suggested, I tried to increase the ratio of Primary antibody ab14820 (1:1000). However, the blot doesn't improve. Please the figure attached. Can we please get a credit note/refund with your company in the future? Thank you for your help. I appreciate it.

ANSWER:

Thank you for contacting us.

Your credit note ID is 20804.

I am sorry that this antibody did not perform as stated on the datasheet. I have asked our accounting department to issue a credit note for you, which can be redeemed against the invoice of a future order by passing it on to your purchasing department. To avoid confusion, please ensure your accounts department is aware of how the credit note is being used. If you have questions on how to use the credit note, please contact our accounting department.

Our accounting department can be contacted by email at us.credits@abcam.com or by telephone using the information at the Contact Us link in the top right corner of our website. Please refer to the credit note ID in any correspondence with our accounting department.

The credit note ID is for your reference only and does not automatically guarantee the credit.

I hope this experience will not prevent you from purchasing other products from us in the future. Our Scientific Support team is always at your service, should you require further expert advice.

phone call: no signal on mouse frozen sections or xenopus WB

ANSWER:

Vielen Dank für Ihren Anruf.
Es tut mir leid zu hören, dass Sie Probleme mit diesem Antikörper haben.
Wei am Telefon diskutiert, sende ich Ihnen hier unsere Fragebogen. Es tut mir leid, dass ich gestern nicht mehr dazu gekommen bin. Durch das Ausfüllen des Fragebogens erhalten wir alle nötigen Informationen über Ihre Proben und Ihr Protokoll. Sobald Sie dieses Formular an uns zurückgeschickt haben, werden wir uns Ihr Protokoll ansehen und möglichst Veränderungsvorschläge machen, die Ihre Ergebnisse verbessern werden. Falls sich herausstellt, dass der Antikörper nicht so funktioniert, wie auf dem Datenblatt beschrieben und er innerhalb der letzten 180 Tage gekauft wurde, werden wir Ihnen gerne einen Ersatz oder eine Gutschrift schicken.
Ich freue mich, bald wieder von Ihnen zu hören.

Thank you for the quick reply.The email and attachment includes all the information I could provide. Can you please give me some suggestions about how can I fix my experiment? Any suggestions are welcomed. I look forward to hearing from you soon and helping me solve the problem.


Could you please confirm if you purchased this product directly from Abcam or via a distributor?



Yes. I purchased directly form Abcam.



It would be very useful for me to know the Abcam Order Number (or your PON) and the date of the purchase.

Purchase order # 53949316

Receipt Date: 04-20-2012





1) Abcam product code ab14820



2) Abcam order reference number or product batch number Lot. GR18771-8



3) Description of the problem

The blots are not shown as the datasheet. Please see the photos I sent.



4) Sample preparation:

Type of sample (whole cell lysates, fraction, recombinant protein…) whole cell lysate from 16HBE14o- and Caco2

Lysis buffer : RIPA buffer

Protease inhibitors: Roche ecomplete proteinase inhibitor cocktail and PMSF

Phosphatase inhibitors

Reducing agent : ß-mercaptoethanol and SDS

Boiling for ≥5 min? yes

Protein loaded ug/lane or cells/lane: about 30-40 ug lysate each lane

Positive control : Both cell lysates have been tested with anti-SETD7 from other company giving the correct size product( 50kDa). On the same gel I have run the same samples for anti-NFYA (Abcam), GR(Santa cruz) at the same time. They are all right.

Negative control I have one lane left only running the dye.



5) Percentage of gel 8%

Type of membrane: PVDF membrane

Protein transfer verified:Yes, Ponceau Red

Blocking agent and concentration: 5% nonfat milk

Blocking time 1hr

Blocking temperature Room temp



6) Primary antibody (If more than one was used, describe in “additional notes”) :

Concentration or dilution 1:2000

Diluent buffer 5% nonfat milk

Incubation time overnight

Incubation temperature:4 degree in cold room



7) Secondary antibody:

Species: Polyclonal Goat Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP,Code No./ Code/ Code-Nr. P 0447

Reacts against: mouse

Concentration or dilution 1:5000

Diluent buffer 5% nonfat milk

Incubation time 1hr

Incubation temperature: Room temp

Fluorochrome or enzyme conjugate:



8) Washing after primary and secondary antibodies:

Buffer 1XTBST buffer

Number of washes three times, 10-15 min each



9) Detection method



10) How many times have you run this staining?

Once only.

ANSWER:

Thank you very much for getting back to me and for passing some useful details. I have looked through the protocol and it seems to be fine.

I have discussed this complaint with my colleagues in the Lab and this antibody has only been tested on Recombinant SET7 system but we do not have any data on endogenously expressed system cell or tissue lysate.

I would like to reassure you that our Abpromise applies to your complaint since you purchased this product within the guarantee period. This means that in the event that a product is not functioning in the applications/species cited on the product data sheet (and the problem has been reported within 6 months of purchase) we will happily offer a credit note/refund to the value of the product purchased.

My suggestion would be to try increasing the final working concentration of the primary antibody i.e. 1/1000 or 1/500 (overnight incubation) to see if the signal is getting stronger or not. If this does not improve the detection, I can certainly arrange the credit note for you or send you a replacement.

I hope this will be useful for you. Should you still have any problem with this antibody after following these suggestions, then please do not hesitate to contact our Technical Department again.