Anti-SIRT1 antibody (ab13749)

vielen Dank für die schnelle Antwort. Ich habe den Fragebogen ausgefüllt, bei weiteren Fragen stehe ich Ihnen natürlich gerne zur Verfügung.
Leider kann ich über unser Email-Programm die Graphik des Western Blots nicht direkt in die Mail einfügen, daher musste ich sie in den Anhang einfügen.

ANSWER:

Vielen Dank für Ihre Antwort und für diese weiteren Informationen.
Es tut mir leid zu hören, dass Sie diese Probleme mit ab13749 haben. Ich habe mit dem Labor, das den SIRT1-Antikörper herstellt, gesprochen und möchte Sie gerne noch etwas fragen bzw. Ihnen gerne folgendes anbieten:
1) Wie lange haben Sie den Blot entwickelt? Laut Literatur gibt es zwei Isoformen von SIRT1, die der Antikörper auch detektieren könnte (82 kDa und 61 kDa, http://www.uniprot.org/uniprot/Q96EB6). Mit den posttranslationalen Modifikationen (Phosphorylierung) und der damit verbundenen Veränderung der Laufeigenschaften können die Proteine durchaus bei höheren Molekulargewichten detektiert werden. Es ist daher nicht auszuschließen, dass die starken Banden bei ca. 72 bzw. 95 kDa spezifisch sind, vor allem, wenn Sie den Blot nicht überexponiert haben.
2) Haben Sie die Zellen irgendeiner Behandlung unterzogen? Eine TNF alpha-Behandlung kann zur proteolytischen Spaltung führen und ein stabiles 75 kDa-Fragment induzieren, was mit Modifikationen dann wieder bei anderen Molekulargewichten als den erwarteten 120 bzw. 82 kDa zu detektieren wäre. Unterschiedliche Kultivierungsbedingungen können durchaus auch zur Folge haben, dass Sie in Ihren MCF7-Zellen keine oder nur eine schwache 120 kDa-Bande sehen, wohingegen der Anwender, der uns den Abreview zugesandt hat, eine deutliche 120 kDa-Bande sieht.
3) Wie hoch erwarten Sie die Überexpression für die transfizierten Zelllinien? Gibt es Voruntersuchungen, die eine Aussage erlauben, wie viel höher die Translation der Konstrukte ist?
Vielleicht wäre es eine Möglichkeit, die Spezifität der Banden mit einem Blockierungspeptid zu überprüfen?! Ich könnte Ihnen gerne das entsprechende Peptid für ab13749 kostenlos zukommen lassen. Wahlweise kann ich Ihnen auch einen anderen SIRT1- Antikörper senden, mit dem Sie die Banden überprüfen könnten (zum Beispiel ab7343 oder ab12193).
Falls dies keine Option für Sie ist, würde ich Sie bitten, mir kurz zu bestätigen, dass der Sekundärantikörper gut funktioniert. Daraufhin kann ich Ihnen dann umgehend eine Gutschrift ausstellen.
Vielen Dank für Ihre Kooperation und Hilfsbereitschaft. Ich freue mich bald wieder von Ihnen zu hören.

Customer Question: I was wondering if you know the exact amino acid specificity of this antibody to the carboxy terminal.

ANSWER:

Hello, The peptide sequence for DB083 SIRT1 is as follows:

NEAISVKQEVTDMNYPSNKS