Anti-SREBP2 antibody (ab30682)

ich hatte ja den SREBP-2 Ak ab72856 mit meinen Meerschweinchenproben
getestet und habe nun Banden auf der richtigen Hoehe, allerdings nur im
Kernhomogenaten (siehe Photo). Also scheint ja leider der andere
(ab30682) nicht spezifisch SREBP-2 zu binden. Ich habe nun allerdings
den abreview hierfuer schon hochgeladen, soll ich dort noch was aendern ?

ANSWER:

Ich möchte vorschlagen, dass Sie die Kreuzreaktion zu vermerken, damit anderen Kunden wissen, dass mit Merschweinchenproben mit Problemen zu rechnen ist.

Sehr geehrtes Support Team,
ich habe ihren SREBP 1 2A4 Antikörper mit Erfolg zur Detektion von
Leberhomogenaten aus dem Meerschweinchen verwendet. Nun wollte ich auch
SREBP 2 im Kernextract detektieren und habe dabei festgestellt das ich
mit einer Konzentration von 2,5 µg/ml und Inkubation über Nacht wirklich
traumhafte Banden erhalte (Alles in 5% BSA in TBST).
Das Problem ist nun nur das diese Banden leider nicht der erwarteten
Größe entsprechen und zwischen 72-95 kDa auftreten (anstelle von 126).
Die Bande knapp unter 72 kDa würde ich als die geschnittene Form
Interpretieren (siehe Abbildung). Ich habe das gleiche Signal (72-95
kDa) auch bei den Gesamthomogenaten erhalten allerdings nur ein sehr
schwaches auf Höhe von 72 kDa, was ja auch zu erwarten war.
Wie aus ihrem Daten Sheet zu entnehmen wurder der AK im Meerschweinchen
nicht getestet. Leider gibt es auch nur eine Publikation, die SREBP im
Meerschweinchen detektiert haben (siehe Anhang). Diese Publikation hat
bei ihren Abbildung leider keine kDa Angaben gemacht. Kann man trotzdem
davon ausgehen das es sich um das gesuchte Protein handelt ? Ich finde
leider auch keine Sequenze oder andere Informationen zu SREBP2 im
Meerschweinchen und hoffe das sie mir helfen können.
Vielen Dank !

ANSWER:

Vielen Dank für Ihre Anfrage.
Die Interpretation Ihrer Ergebnisse ist wirklich nicht einfach! Ich hoffe, dass ich Ihnen trotzdem ein wenig weiterhelfen kann:
Zuerst möchte ich fragen, welche unserer SREBP- Antikörper Sie verwendet haben. Aus unseren Unterlagen entnehme ich, dass es vermutlich ab3259 und ab30682 waren. Können Sie das bestätigen?
Ich stimme Ihnen vollkommen zu, dass es kein Zeichen guter wissenschaftlicher Praxis ist, bei der Veröffentlichung von Daten keine Angabe zum Molekulargewicht zu machen! Das einfachste wäre hier vielleicht für Sie, die Autoren direkt zu kontaktieren und nach der Größe von SREBP2 (Precursor und geschnittene Form) zu fragen.
Bei meinen Recherchen konnte ich herausfinden, dass das Immunogen von ab30682 eine Sequenzähnlichkeit von 100% gegenüber dem vermuteten Ortholog des Meerschweins aufweist (Cavia porcellus, SwissProtID H0VN68, http://www.uniprot.org/uniprot/H0VN68, siehe auch Anhang). Daher ist es sehr wahrscheinlich, dass der Antikörper kreuzreagiert, auch wenn wir das bisher nicht getestet haben (und daher leider auch nicht garantieren können).
Um nun zu bestimmen, welche Bande die richtige ist, gäbe es verschiedene Möglichkeiten:
1) Haben Sie ein no-primary-Kontrolle durchgeführt? So könnte man die Banden bestimmen, die durch unspezifische Bindung des Sekundärantikörpers verursacht werden.
2) Aus unbekannten Gründen ergeben Antikörper mit verschiedenen Blockierungsmitteln unterschiedliche Ergebnisse. Vielleicht verbessert eine Blockierung mit 5% Milchpulver (und dann dementsprechend 0-0.5% Milchpulver im Antikörperverdünnungspuffer) die Signale, so dass die spezifische Bande stärker wird (die ich übrigens auch bei unter 72 kDa vermuten würde).
3) Um Unterschiede zu erkennen, würde ich Ihnen empfehlen, Gesamtzelllysate, Kernextrakte und eventuell die cytoplasmatische Fraktion auf dasselbe Gel aufzutragen. Dies würde dann das shuttling zwischen ER/Golgi und Kern zeigen. Das gleiche gälte für behandelte Proben: Wenn Sie die Möglichkeit hätten, die Expression bzw. Prozessierung von SREBP2 zu induzieren (mit TCDD?), könnte das zur Klärung beitragen.
4) Es gäbe auch die Möglichkeit, dass Sie Ihre Proben mit alternativen Antikörpern gegen ein anderes Epitop auf SREBP2 testen, um die bisherigen Ergebnisse zu bestätigen. Unsere anderen Antikörper wurden zwar bisher noch nicht im Meerschwein getestet; allerdings weisen alle Immunogen eine Ähnlichkeit von 92-100% auf und können daher kreuzreagieren.
ab28482:
http://www.abcam.com/index.html?datasheet=28482 http://www.abcam.com/index.html?datasheet=28482.
ab72856:
http://www.abcam.com/index.html?datasheet=72856 http://www.abcam.com/index.html?datasheet=72856.
ab112046:
http://www.abcam.com/index.html?datasheet=112046 http://www.abcam.com/index.html?datasheet=112046.
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Ich hoffe, diese Informationen helfen Ihnen weiter. Ich wünsche Ihnen viel Erfolg bei Ihrem Projekt und würde mich freuen von Ihnen zu hören, wie Sie vorankommen. Falls Sie einen Rabattcode erhalten möchten oder weitere Fragen haben, zögern Sie bitte nicht, sich wieder an mich zu wenden.

ab30682 à tester chez le hamster chinois

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Nous restons à votre disposition pour plus d’informations concernant cette offre promotionnelle. Dans l’attente de recevoir votre Abreview nous vous souhaitons bonne chance dans vos recherches.

Termes et Conditions : www.abcam.com/collaborationdiscount.

I reuse the aliquots, but we stored them a 4ºC and we add sodium azide (0.05%) as a preservative. I already tested this procedure with other abcam antibodies and I never had any problems with that.

ANSWER:

Thank you for your reply.

I would recommend testing a fresh aliquot and dilution. I agree that most antibodies can be reused several times and are okay to store at 4C with sodium azide. This may be a case in which these antibodies can only be used about two times before significantly losing activity.

If you are not able to obtain a strong signal even with a freshly diluted antibody, please let me know and I am happy to replace the antibodies for you.

I hope this information is helpful. Please do not hesitate to contact us if you have any additional questions.

Good afternoon,

I have been preformed some western blots with antibodies against SREBP1 (ab3259) and SREBP2 (ab30682) that we bought from your company in rat liver samples. They work very nice during the first 2 incubations (made last week) but now they stop working...I already add more antibody (reduced the dilution) but the signal, if detected, is very light (and the samples are the sample since I am trying to have replications). Can you help me solving this problem? (I followed the conditioning the abcam suggest in the data sheet..). 

Additionally, when I tested the antibodies I found 3 bands for both SREBPs antibodies: one at ~125kDa (precursor); one at 70 and finally one at 60 kDa (cleaved/activated forms?). Should I considered both 60 and 70 kDa bands the cleaved/activated form or they result of other type of post-translational transformation ?

ANSWER:

Thank you for contacting Abcam regarding ab3259 and ab30682.

I want to clarify your initial question regarding your usage of these antibodies. When you say that they worked well for the first 2 incubations - are you reusing the diluted primary antibody? If so, how are you storing them between uses? Have you added a preservative to the solution? I am concerned that if the antibody is stored at 4C for an extended period of time bacterial growth can lead to decreased performance.

Regarding the banding pattern, it appears that these antibodies will detect 3 bands at the molecular weights you are observing. The 126kDa and 60kDa bands represent the precursor and cleaved forms and we are not sure of the identity of the third band.

I hope this information is helpful. I look forward to your reply so that I may assist you further. Please do not hesitate to contact me if you have any additional questions.