Anti-STAT5 antibody - ChIP Grade (ab7969)

Merci pour ces recommandations. J’ai refait encore une fois de nouveaux blots en utilisant TBS-Tween, en augmentant la durée du transfert et en augmentant la concentration des anticorps (1:180 pour pstat5 et 1:500 pour stat5). J’ai également confirmé avec le producteur que le blocking buffer ne contient pas de caséine. Finalement je n’ai toujours pas de bandes aux hauteurs attendue pour STAT5 et phospho STAT5.

Pour ce qui est de JAK2 (ab37226), la bande est toujours aussi fine et difficilement quantifiable même avec différentes concentrations d’anticorps (1:250 ou 1:500: même conditions que décrits pour les blots STAT5 et pSTAT5). J’ai toutefois obtenu une bande pour phospho Jak2 qui est bien meilleure que celle pour JAK2 totale donc je suis satisfaite de cet anticorps.

J’ai utilisé plusieurs gels et passé beaucoup de temps à travailler sur ces optimisations selon vos recommandations et à ce moment-ci je crois qu’il est raisonnable de demander un remboursement pour ces trois anticorps. Je vous remercie toutefois de votre assistance.

ANSWER:

Merci pour votre émail.

Je suis très désolée d'apprendre que les recommandations n'ont pas permis d'améliorer les résultats. Comme déjà expliqué auparavant, la qualité est très importante pour nous, et nous allons suivre ces anticorps pour voir s'il y avait un problème que dans les échantillons que vous avez reçu ou aussi avec des autres unités.

Je suis désolée pour que vous avez reçu des anticorps fautifs.J'ai demandé à notre service comptabilité de mettre en place un avoir référence CN.

Votre référence CN est xx.

Voici les manières dont vous pouvez utiliser cette référence CN:
(1) la faire valoir contre la facture originale si celle-ci n'as pas encore été payée
(2) la faire valoir contre une prochaine facture
(3) obtenir un remboursement de la somme entière si vous n'avez pas de factures actuellement en cours avec Abcam

Si vous souhaitez recevoir un remboursement au lieu d'un avoir, veuillez demander à votre service de gestion de prendre contact avec notre département comptabilité afin que nous puissions recueillir les informations nécessaires pour cette restitution. Notre service comptabilité peut être contacté par courriel à l'adresse creditcontrol@abcam.com ou par téléphone en utilisant le lien « Contactez-nous » dans le coin en haut à droite de notre site internet. Veuillez communiquer votre numéro d'avoir lorsque vous contactez notre service comptabilité.

Vous recevrez également la référence complète de la note de crédit par courriel ou par voie postale; cette référence commençant par les lettres CGB.

J'espère que cette expérience ne vous empêchera pas de commander à nouveau l'un de nos produits.

L'équipe technique reste à votre disposition pour plus de conseils.

Bonne continuation dans votre recherche.

Bonjour,

En attachement je vous envoie les réponses au questionnaire que vous m’avez envoyé pour les anticorps phospho Stat5 et stat5. Je vous envoie également le blot pour bactin, stat et pstat5 que je vous ai envoyé la semaine dernière avec la lignée U87.

Comme vous voyez, rien n’est apparu pour le contrôle positif (A431 traité avec EGF) (voir image bactin, pstat5 et stat5; 7ieme colonne) aux hauteurs attendues de stat5 et stat5 phosphorylé (autour du 5ieme marqueur de poids qui est de 100 kda), malgré que le blotting avec beta-actin montre une très forte bande pour cetéchantillon (entre le 7ieme et 8ieme marqueur). La bande plus basse dont je vous ai parlé précédemment sont ressorties encore dans mes échantillons d’extraits totaux avec l’anticorps stat5 (colonnes 1-6), mais pas dans l’extrait nucléaire A431 donc j’assume que ce n’était pas une bande spécifique.

Une très fine bande est apparue pour JAK2 à la hauteur attendue la semaine dernière avec une nouvelle lignée que j’ai utilisé (LN229) donc je retire ma plainte pour cet anticorps. Rien n’est apparu pour phospho JAK2 mais puisque la bande de jak2 était très fine, il est possible que ce ne soit qu’une question de quantité de protéine. Je vous recontacterai si j’ai encore des problèmes avec cet anticorps.



Merci encore pour votre assistance.

Cordialement,

ANSWER:

Merci beaucoup pour tous ces information supplémentaires.

Je suis désolée de voir que vous avez des problèmes avec les anticorps contre Stat. J'ai étudié les informations que vous nous avez fait parvenir, et j'aimerais bien discuter les points suivants avec vous:

1.) Est-ce que vous avez testé des différents dilutions d'anticorps primaires? Effectivement, l'ab37138 était utilisé à 1/180 pour obtenir l'image que vous voyez sur la fiche technique. Je peux donc conseiller de tester aussi une dilution similaire pour cet anticorps.

2.) Est-ce que dans le tampon de blocage superblock il a des protéines de lait? La détection des protéines phosphorylées peux être inhibié par la caséine, car la caséine est une protéine très phosphorylé. De même, nous recommandons d'utiliser du TBS et non du PBS pour marquer des protéines phoshorylées. Je vous recommande donc de vérifier avec le producteur que le superblock est adapté pour détection de phosphoprotéines. Alternativement, je vous conseiller de faire le blocage et les dilutions d'anticorps dans un tampon TBS avec de la BSA.

3.) Il se peux que le Stat5 se trouve dans le cytoplasme. Effectivement, si j'ai bien compris, d'après SwissProt et PubMED 15534001, le Stat5 est transloqué dans le nucléus que après phosphorylation. http://www.uniprot.org/uniprot/P42229

J'espère que ces informations vous sont utiles. Veuillez s'il vous plaît me tenir au courant de comment vous avancez. N'hésitez pas à nous recontacter si vous avez des questions ou si vous voulez discuter un point.

Je suis aussi heureuse de savoir que les anticorps Jak2 vous ont donné un signal. N'hésitez pas à nous re-consulter si vous voyez l'utilité.

Merci de votre collaboration. Je me réjouis d'avoir de vos nouvelles.

Merci pour votre réponse. Je vais fournir les réponses au questionnaire avant la fin de la semaine. J’essaie une autre fois cette semaine avec pjak2 et jak2. J’ai une question: dans le buffer de lyse, est-ce que vous recommendez d’utiliser un inhibiteur de phosphatase et protéase? Qu’en est-il pour l’EDTA? Est-ce que l’usage d’un de ces réactifs pourrait empêcher la fixation de l’anticorps?

ANSWER:

Merci pour votre émail et votre collaboration. Je me réjouis de recevoir les informations additionnelles de votre part, qui nous permettrons donc d'étudier mieux ce cas.

Pour le tampon de lyse, nous conseiller d'ajouter toujours des inhibiteurs de protéases. Ceci est surtout crucial pour les tissus, ou plusieurs protéases sont présents. Si vous voulez détecter des protéines phosphorylés, il est impérative d'ajouter des inhibiteurs de phosphorylation, car les phosphatases sont ubiquitaires. Je peux donc conseiller, d'ajouter des inhibiteurs de phosphates et de protéases, ainsi que de travailler toujours sur glace avec ces lysats. L'ajout de l'EDTA dans le tampon de lyse n'est pas forcement nécessaire, il est conseillé pour des tampons de lyse spécifiques, comme pour les protéines du cytosquelette.
Aucunde ces réactives va empêcher la fixation de l'anticorps en Western blot - en tout cas je n'ai jamais entendu quelque chose comme ça, et comme les protéines sont dénaturées et séparé du tampon parla migration, je ne peux pas m'imaginer que ceci pourrait avoir un effet.

J'espère que ces informations sont utiles. Pour plus de détails, je peux recommander de consulter nos protocoles en ligne pour la préparation des échantillons ainsi que pour le Western blot des phosphoprotéines.
http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11379#A
http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11406

Je me réjouis d'avoir de vos nouvelles. N'hésitez pas de nous recontacter en attendant si vous avez des questions.

Je vous remercie d’avoir envoyé le lysat nucléaire. Je dois toutefois vous avouer que rien n’est apparu (voir image bactin, pstat5 et stat5; 7ieme colonne) aux hauteurs attendues de stat5 et stat5 phosphorylé (autour du 5ieme marqueur de poids qui est de 100 kda), malgré que le blotting avec beta-actin montre une très forte bande pour cetéchantillon (entre le 7ieme et 8ieme marqueur). La bande plus basse dont je vous ai parlé précédemment sont ressorties encore dans mes échantillons d’extraits totaux avec l’anticorps stat5 (colonnes 1-6), mais pas dans l’extrait nucléaire A431 donc j’assume que ce n’était pas une bande spécifique.

De plus, pour les anticorps JAK2 total (ab37226, lot GR68219-1) et phosphorylé (ab68268, lot GR70589-1) que j’essaie pour la première fois ont également montré des bandes prominentes à 10-30 kda (voir image ghr, pjak2 et jak2) et rien aux hauteurs attendues (entre le 4ieme marqueur de poids = 130 et le 5ieme marqueur = 100 kda). Je suis toutefois confiante de la qualité de mes extraits, gels et blot car l’anticorps contre le GHR (ab78426; au niveau du 6ieme marqueur de poids) et contre la beta actin (ab8226; voir autre image) ont tous deux montré de belles bandes aux hauteurs attendues.

Je dois avouer que 4 anticorps sur 6 qui ne fonctionnent pas n’est pas un très bon taux de succès. Tout ceci représente beaucoup de temps et d’argent. Je vous prie de m’informer sur ce qui est possible à cette étape-ci.

Merci

ANSWER:

Merci pour votre patience pendant que j'ai étudie ce problème.

Je suis désoléed'entendre que vous avez eu un problème avec quatre de nos anticorps.Je veux d'abord vous rassurer, que nous garantissons tous nos produits de fonctionner tel que décrit sur leur fiche technique (sous réserve d'une commande ultérieure de 120 jours). Pour déterminerla source du problème ainsi quesi c'est l'anticorps qui est endommagé, nous essayons d'investiguer le problème d'abord.Je peux aussivous rassurer que tous ces quatre anticorps sont relativement populaires, et que nous n'avons pas eu des autres retours négatives pour au moins une année pour aucun de ces anticorps.
Je sais que vous en avez déjà discuté du protocole avec mon collègue. Mais commel'envoie du contrôle positiven'as pas résolu le problème et comme vous reportez maintenant aussi un problème avecdes autresanticorps, j'espère que vous comprenez que nous aimerions investiguer ceci encore une fois en plus de détails. Veuillez trouver ci-joint donc un questionnaire qui nous permet de regrouper le plus d'informations possible sur le protocole que vous avez utilisé avec ces anticorps. Veuillez s'il vous plaît remplir un questionnaire par anticorps/group d'anticorps. Celui-ci nous permettra de vous fournir la meilleure assistance technique. Est-ce que vous pouvez aussienvoyer encore une fois les images que vous avez envoyé, mais dans un autre format (comme jpg ou ppt)? Malheureusement je n'ai pas pu ouvrir ces images.

Si nous déterminons que ces tubes que vous avez reçu sont endommagées, nous allons vous les remplacer ou rembourseren accord avec notre garantie.

Je vous remercie par avance de nous envoyer votre protocole.

Oui d’accord, j’apprécierais un lysat d’une des deux lignées, n’importe laquelle. Ce serait donc un bon contrôle pour stat5 total et phosphorylé?

ANSWER:

J'ai mis en place l'envoi d'une unité gratuite de lysat de A431 (Human epithelial carcinoma cell line) Nuclear Lysate - EGF treated, référence ab14635. Le numéro de commande est : *****.

Ce lysat est recommandé comme contrôle positif pour STAT5 phosphorylé et devrait convenir également pour l'anti-STAT5 ab7969.

J'espère que ce lysat vous sera utile. N'hésitez pas à nous contacter de nouveau si vous avez d'autres questions.