Anti-mtTFA antibody [18G102B2E11] (ab119684)

1) Code du produit Abcam ab119684

2) Numéro de commande Abcam ou le numéro de lot/batch xx Description du problème Bande située à 29Kda au lieu des 20KDa indiqués

4) Préparation de l’échantillon :

Type d’échantillon (lysat cellulaire, fraction, protéine recombinante …) :

Tampon de lyse 50mM TRISHCL / 150mM NaCl / 0.5% NP / 0.25% Sodium Deoxycolate / 0.1% SDS

Inhibiteurs de protéases 1mM PMSF + Complete mini 1X (Roche 11836153001)

Inhibiteurs de phosphatases NON

Agent réductant Laemli 1X final

95oC pendant ≥5 min? oui/non OUI

Protéine/puits en mg ou nombre de cellules/puits 25µg

Contrôle positif NON

Contrôle négatifxx

5) Pourcentage du gel Stacking: 4% / Separating: 12%

Type de membrane PVDF

Vérification du transfert NON

Tampon de saturation et concentration Lait 5% en TBS-Twenn

Temps d’incubation de la saturation 1 Heure

Température de saturation Température ambiante (environ 24°c)

6 Anticorps primaire (utilisation de plusieurs anticorps, description dans “notes supplémentaires”) :

Concentration ou dilution 1/1000

Tampon diluant TBS-Tween + 0.1% lait

Temps d’incubation 1 Heure

Température Incubation Température ambiante (environ 24°c)

7) Anticorps secondaire :

Espèce

Réagit contre Mouse

Concentration ou dilution 1/15000

Tampon de dilution TBS-Tween

Temps d’incubation 1 Heure

Température d’incubation Température ambiante (environ 24°c)

Fluorochrome or enzyme conjuguée Peroxydase

8) Lavage après les anticorps primaire et secondaire :

Tampon TBS-Tween

Nombre de lavage 3 fois

Temps d’incubation du lavage 5 minutes

9) Méthode de détection: ECL + (Ge Healthcare RPN 2132)

10) Combien de fois avez vous essayer ce Western Blot ? environ 6 fois

Obtenez-vous toujours le même résultat ? OUI

Quelle étape avez vous optimisée ?

Aucune, car, même si elle n’est pas située au poids apparent attendu, c’est la seule bande apparaissant sur le film…

ANSWER:

Merci d'avoir pris le temps de remplir notre questionnaire et de nous avoir contactés. Je suis désolée que vous avez des problèmes avec l'interprétation de deux de nos anticorps.

Comme expliqué auparavant, notre politique est d'offrir tout d'abord la meilleure assistance technique. Si jamais nous concluons que le produit que vous avez reçu ne fonctionne pas comme mentionné sur sa fiche technique et que ce produit a été commandé sous 180 jours, nous nous ferons un plaisir de vous offrir un remplacement gratuit ou un avoir en compensation.

J'aimerais donc vous offrir quelques suggestions afin d'optimiser vos résultats. J'apprécierais si vous pouviez confirmer quelques détails de la procédure.

1.) Comme écrit dans mon premier émail, est-ce que vous avez vérifié que le tampon du migration est compatible/adapté au marquer de poids? Effectivement, suivant le tampon, l'échelle dans le tampon peux varier beaucoup. Pour illustration, je peux vous recommander de voir l'image comparative d'un de nos marqueurs en différents tampons: Click here (or use the following: http://www.abcam.com/index.html?datasheet=115832).

2.) Il existent deux isoformes du mtTFA. Celles-ci sont décrites dans la base de données SwissProt chez la souris: http://www.uniprot.org/uniprot/P40630 La deuxième isoforme a un poids moléculaire attendu de 25kD et est appelé isoforme nucléaire.

3.) Je peux vous conseiller de tester des autres cellules, comme les cellules Hela, en parallèle comme test. Ceci afin d'exclure que dans les fibroblastes une nouvelle isoforme soit exprimé.

4.) Est-ce que vous pouvez confirmer aussi que vous avez utilisé des extrait totaux?

J'espère que ces informations vous aideront. Si nos suggestions ne permettent pas d'améliorer vos résultats, n'hésitez pas à me recontacter pour plus d'assistance.

Nous avons récemment testé deux références d’anticorps :
1. Anti-Surf1 antibody [21H2BG4] (ab110256)
2. Anti-mtTFA antibody [18G102B2E11] (ab119684)
Pour ces deux références, nous avons bien obtenu une ou plusieurs bande(s). Mais aucune bande prédominante située au poids moléculaire attendu (Voir le .pdf joint)
Tous nos WB ont été fait à partir d’extraits protéiques issus de Fibroblastes humains.

En ce qui concerne SURF1, nous somme en possession de cellules de patients mutés dans pour cette protéine. Je vous présente leurs résultats dans le .pdf. Certains d’entre eux voient la bande (au mauvais poids moléculaire) disparaître, mais pas tous…Est-ce bien cette bande ? car il n’y aucune bande au poids moléculaire attendu. Il est dit dans la fiche technique que la quantité de la protéine SURF1 est faible dans les cellules.
Pour mtTFA, nous n’avons aucun moyen de vérifier que cette bande est bien la bonne. Hormis le fait que cette bande est de loin prédominante sur les autres et que ses variations vont dans le sens de notre hypothèse… ce qui est un peu juste

Auriez-vous eu quelques échos de personnes travaillant avec ces anticorps sur le même matériel cellulaire, c'est-à-dire fibroblastes humains ?
Ont-il observé ces mêmes différences ?
Vous a-t-on fait remarqué ces différences dans d’autres types cellulaire ?

ANSWER:

Je suis désolée d'apprendre que ces anticorps ne vous donnent pas de résultats satisfaisants en Western blot - c.à.d. une bande à environ 42kD pour SURF1 et à environ 24kD pour mtTFA).
Nous n'avons pas eu des autres retours négatives et n'avons pas non plus eu des indications autres d'un problème avec ces anticorps. Nous n'avons pas non plus eu des feedback autres des gens utilisant ces anticorps sur des cellules similaires.
Comme la qualité de nos produits est très imporante pour nous, nous aimerions bien investiguer en plus de profondeur le problème que vous avez avec ces anticorps. Veuillez pour ceci nous fournir un peu plus d'information s'il vous plaît. Pour ceci je vous ai joint un questionnaire qui nous permet de regrouper le plus d'informations possible sur le protocole que vous avez utilisé avec cet anticorps..
En regardant les informations que vous nous aviez déjà envoyé, j'aimerai bien noter les points suivants:
1.) Est-ce que vous avez vérifié que le tampon du migration est compatible/adapté au marquer de poids? Effectivement, suivant le tampon, l'échelle dans le tampon peux varier beaucoup. Pour illustration, je peux vous recommander de voir l'image comparative d'un de nos marqueurs en différents tampons: Click here (or use the following: http://www.abcam.com/index.html?datasheet=115832).
2.) Il existent deux isoformes du mtTFA. Celles-ci sont décrites dans la base de données SwissProt chez la souris: http://www.uniprot.org/uniprot/P40630 La deuxième isoforme a un poids moléculaire attendu de 25kD et est appelé isoforme nucléaire.
Je me réjouis de recevoir votre réponse avec les informations additionnelles afin de pouvoir continuer à investiguer ce problème.
Si nous concluons que notre produit est fautif et ne fonctionne pas comme explicité par notre fiche technique, nous serons ravis de mettre en place l'envoi d'un tube de remplacement gratuit ou d'un remboursement (sous réserve d'une commande ultérieure de 180 jours).