Question (33793) | Anti-DDDDK tag antibody (ab1162)

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Question


Gracias por tu rápida respuesta.

Respecto a la queja para el anticuerpo ab1162 ya he rellenado todo el formulario, igualmente te lo resumo. El anticuerpo tanto para wb como para immunoprecipitación funciona perfectamente, pero para immunofluorescencia no es específico, ya que cuando lo pruebo tanto en células sin transfectar o transfectadas con el plásmido vacío que utilicé inicialmente para clonar luego mi proteína, la señal luego en el microscopio es muy fuerte en ambos casos. Vaya, que no hay diferencia de señal entre que exprese mi proteína con el tag (flag) o no la exprese. Y claro, eso no debería ser posible ya que el tag Flag es totalmente artificial.

Te adjunto unas imágenes tomadas en células HEK293T en las condiciones que antes te describía (plásmido vacío y con inserto) y verás que no hay especificidad alguna.
En fin, gracias por todo!

Answer

Te agradezco mucho que nos hayas facilitado mas detalles del protocolo y te hayas tomado la molestia de enviar las imágenes.

Es evidente que el anticuerpo no es especifico contra el DDDDK tag visto que da la misma señal en células transfectas y en células sin el tag unido a la proteína. Es curioso, sin embargo, que si lo sea en WB e IP. ¿Habéis utilizado el mismo control negativo en WB?

Me comentas que este problema lo tuvisteis en el pasado, en el momento de adquirir el anticuerpo, por lo que entiendo que podemos descartar que el problema se deba a la perdida de actividad debido a las condiciones de almacenamiento del mismo a lo largo del tiempo (para mantener en perfecto estado los anticuerpos durante más de un año, se recomienda guardarlos a -20C).

El protocolo parece perfecto, no creo que ninguna mejora que pueda hacerse haga obtener una señal más específica. En estos casos es importante comprobar que tanto la transfección del plásmido a la célula se ha realizado con éxito, así como la inserción del tag en la proteína diana. En vuestro caso lo habéis comprobado con otras técnicas, por lo que no cabe duda acerca de ésto.

Quizás ayudaría a mejorar el resultado intensificar las condiciones de permeabilización de las células. Solemos recomendar si se usa Saponin, una concentración al 0.5% durante unos diez minutos.





Así que quedo a la espera de que me indiques la mejor solución para vosotros. Si tienes cualquier otra consulta, por favor, no dudes en volver a contactarnos.

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