Question (46431) | Anti-HCV subtype 1b NS5B antibody [10D6] (ab100895)

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Question

hier ist der ausgefüllte Fragebogen.
Mit freundliche Grüssen,

1) Abcam product code: ab100895
2) Abcam order reference number or product batch number:
3) Description of the problem: Nonspecific binding on Western blot, no specific bands with genotype 2A
4) Sample preparation:
Type of sample (whole cell lysates, fraction, recombinant protein…): whole cell lysate
Lysis buffer: RIPA
Protease inhibitors: PMSF, AEBSF, 104 mM, Aprotinin, 80 μM,Bestatin, 4 mM
E-64, 1.4 mM, Leupeptin, 2 mM, Pepstatin A, 1.5mM
Reducing agent:: SDS, 2-mercaptoethanol
Boiling for ≥5 min? yes
Protein loaded ug/lane: 70 µg
Positive control: yes, HCV core / ns5a antibody staining
Negative control: yes, uninfected cell lysate
5) Percentage of gel
Type of membrane: Hybond ECL
Protein transfer verified: yes, marker is well transferred and other antibodies work well
Blocking agent and concentration: 10% milk-TBST
Blocking time: 1h
Blocking temperature: RT
6) Primary antibody (If more than one was used, describe in “additional notes”) : HCV NS5b, HCV Core, HCV NS5a
Concentration or dilution 1:1000
Diluent buffer: 1% milk-TBST
Incubation time: over night
Incubation temperature: 4°C
7) Secondary antibody: goat-anti mouse HRP labeled
Species: goat
Reacts against: mouse
Concentration or dilution 1:10000
Diluent buffer: 1% milk-TBST
Incubation time: 1h
Incubation temperature: RT
Fluorochrome or enzyme conjugate: HRP
8) Washing after primary and secondary antibodies:
Buffer: TBST
Number of washes: 3 times
9) Detection method: ECL
10) How many times have you run this staining? 2x
Do you obtain the same results every time? yes
What steps have you altered to try and optimize the use of this antibody?
Document attachment: Attaching images of your blot is strongly recommended and can greatly speed up our investigation of your problem.

Answer

Vielen Dank dafür, dass Sie sich die Zeit genommen haben, unseren Fragebogen auszufüllen.



Es tut mir leid, dass Sie Probleme mit unserem Antikörper hatten.

Um Ihr Problem zu lösen, möchte ich die folgenden Vorschläge zu Veränderung Ihres Protokolls machen:

1. Um eine Maskierung Ihres Zielproteins zu vermeiden, möchte ich vorschlagen, den Gehalt der Blocksubstanz auf maximal 5% abzusenken. Wie meine Kollegin schon anmerkte, haben wir die Erfahrung gemacht, dass BSA in vielen Faellen das bessere Blockmittel ist.

2. Um die Nebenbanden abzuschwächen, mochte ich vorschlagen die Proteinladung auf 30 ug pro Bahn zu reduzieren: So sollte noch genügend Zielprotein vorhanden sein, allerdings wird die Möglichkeit der unspezifischen Bindungen reduziert.

3. Leider wurden keine Angaben zum Gel gemacht: Handelt es sich um ein natives oder reduzierendes Gel? Die meisten unserer Antikörper wurden nur unter denaturierenden/ reduzierenden WB Bedingungen getestet. Ich möchte daher vorschlagen, ein reduzierendes Gel zu verwenden, falls Sie dies nicht schon tun.


Bitte lassen Sie mich wissen, ob ich Ihnen helfen konnte. Wenn ein Antikörper nicht so funktioniert wie wir diesen auf unserem Datenblatt beschreiben, bieten wir unseren Kunden gerne einen kostenlosen Ersatz, eine Gutschrift oder eine Erstattung an, wenn das Produkt wie auf dem Datenblatt beschrieben behandelt und innerhalb von 180 Tagen nach Erhalt reklamiert wurde.

Sie nicht, sich wieder bei uns zu melden, falls Sie weitere Fragen haben.




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