ChIC/CUT&RUN을 이용한 염색질 프로파일링

영국 바브라햄 연구소(Babraham Institute)의 클라우디아 셈프리치(Claudia Semprich)가 작성한 글을 바탕으로 작성된 이 안내서는 ChIC/CUT&RUN에 대한 포괄적인 개요를 제공하며, 이 방법은 기존의 ChIP 기법에 비해 주목할 만한 장점을 가지고 있습니다.

크로마틴 면역절단 기법은 높은 해상도와 낮은 배경 신호로 단백질-DNA 상호작용을 매핑하는 우리의 능력을 획기적으로 발전시켰다. 특정 유전체 위치에서의 단백질 결합을 매핑하기 위한 표적 접근법으로 크로마틴 면역 절단(ChIC)을 확립한 Laemmli 연구실의 초기 연구(Schmid et al., 2004), 최신 방법들을 통해 이제는 극소수의 세포만으로도 전장 유전체 프로파일링이 가능해졌다.

이 연구에서 2017, Henikoff 연구실은 최소한의 시퀀싱 깊이만으로도 높은 신호 대 잡음비를 제공하는 차세대 염색질 프로파일링 기법인 CUT&RUN(Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease)을 소개했다(Skene & Henikoff, 2017; Skene et al., 2018). CUT&RUN은 대상 단백질에 대한 항체를 통해 염색질로 유인되는 recombinant 단백질 A/G–micrococcal nuclease(pA/G‑MNase) 융합 단백질을 사용합니다 (Meers et al., 2019). calcium에 의해 활성화되면, MNase는 결합된 단백질에 인접한 DNA를 절단하여 표적 단편을 용액으로 방출합니다. 이러한 단편들은 정제된 후 고처리량 시퀀싱을 위해 준비될 수 있으며, 이를 통해 transcription factor 결합 및 히스톤 변형 패턴에 대한 전장 유전체 분석이 가능해집니다.

CUT&RUN은 ChIC를 전장 유전체 수준으로 확장한 것으로, 유사한 pA-MNase 전략을 사용하지만 일반적으로 서던 블롯(Southern blot)이나 기타 표적 분석법을 통한 유전자좌 특이적 분석으로 제한된다(Schmid et al., 2004). 반면, CUT&RUN은 온화한 반응 조건, 낮은 배경 잡음, 간편한 library 준비 과정을 갖추고 있어, 소량 시료 및 희귀 세포 시료를 포함한 고감도가 요구되는 응용 분야에 적합합니다.

이와 관련된 방법인 염색질 내인성 절단(ChEC)은 MNase를 연구 대상인 내인성 단백질에 직접 융합시켜 게놈 전반에 걸친 결합 부위를 규명하는 방식이다(Schmid 외, 2004; Zentner 등, 2015). ChEC는 강력한 방법이지만, MNase 태그가 부착된 단백질을 생성해야 하기 때문에, 다음과 같은 항체 기반 접근법과 비교했을 때 처리량과 활용도가 제한됩니다. ChIC 및 CUT&RUN과 같은 항체 기반 접근법에 비해 처리량과 활용도가 제한됩니다..

최근 헤니코프 연구실은 CUT&RUN 표적화 전략을 차용하되, MNase 대신 시퀀싱 어댑터가 부착된 protein A/G–Tn5 트랜스포아제를 사용하는 ‘Cleavage Under Targets and Tagmentation(CUT&Tag)’ 기법을 도입했다. 항체 결합 및 pA/G–Tn5의 고정화 후, 마그네슘을 이용한 activation이 이루어지면 그 자리에서 태그멘테이션이 촉발되어, DNA를 절단하는 동시에 표적 부위에 어댑터를 삽입합니다. CUT&Tag는 배경 신호가 매우 낮으며, 정제 과정을 최소화하여 반응물에서 바로 시퀀싱에 바로 사용할 수 있는 library를 생성할 수 있어, 저입력, 단일 세포 및 고처리량 응용 분야에 매우 적합합니다.

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ChIC/CUT&RUN 프로토콜 개요

1. 핵 준비 및 bead 고정화

분리된 핵은 콘카나발린 A로 코팅된 magnetic bead에 결합되어, 세척 단계 전반에 걸쳐 상층액을 효율적으로 처리하고 안전하게 제거할 수 있도록 합니다.

2. 투과성 증진 및 항체 결합

세포핵을 부드럽게 투과성 처리한 후, 표적 단백질을 인식하는 항체와 함께 incubation을 수행합니다. 이 항체는 후속 효소 활성화를 적절한 염색질 영역으로 국한시킵니다.

3. protein A/G-MNase의 정제

Recombinant protein A/G–MNase fusion protein binds to the primary antibody, tethering MNase precisely to the chromatin-bound target site.

4. calcium 의존적 절단

Ca²⁺를 첨가하면 MNase가 활성화되어 항체-단백질-DNA 복합체의 양쪽에서 DNA를 절단합니다. 이로 인해 짧은 DNA 단편이 방출되어 핵 밖으로 확산되어 상층액으로 이동한다.

5. 단편 회수 및 library 준비

분리된 DNA 단편을 회수하고 정제한 후, 표준적인 말단 복구, 어댑터 연결 및 PCR 증폭 과정을 거쳐 시퀀싱에 바로 사용할 수 있는 library를 생성합니다.

6. 전장 유전체 프로파일링

NGS 분석을 통해 관심 단백질이 게놈 전체에 걸쳐 어떻게 분포되어 있는지 파악할 수 있다. 특정 유전자좌에서 시퀀싱 reads를 농축하면 결합 부위나 히스톤 변형 양상에 대한 고해상도 정보를 얻을 수 있다.

ChIC/CUT&RUN 프로토콜의 개략도. 세포핵은 자성 콘카나발린 A bead에 부착되어 있어, 각 세척 단계 후에도 취급이 용이하고 용액을 안전하게 제거할 수 있습니다. 세포핵의 투과성을 높인 후, 대상 단백질에 대한 항체와 동시에 incubation을 진행한다. protein A/G-MNase 융합 단백질은 표적 단백질에 대한 항체에 결합합니다. Ca가^Ca²⁺ 이 첨가되면, MNase는 형성된 복합체의 양쪽에서 DNA를 절단하여 DNA 단편을 방출하고, 이 단편들은 핵 밖으로 확산된다. 이 DNA를 추출하여 말단 복구 및 어댑터 연결 방식의 DNA library 구축에 활용할 수 있습니다. NGS는 특정 영역 내 서열의 출현 빈도를 통해 대상 단백질의 결합 프로파일을 파악할 수 있게 해줍니다.

ChIC/CUT&RUN과 ChIP-Seq의 관계

CUT&RUN 는 염색질 면역침전 및 시퀀싱(ChIP-seq)을 대체하기 위해 개발되었으며, 기존의 ChIP 기반 워크플로우가 지닌 여러 한계를 해결합니다. 두 방법 모두 특정 단백질과 결합된 DNA를 분리하는 데 항체를 이용하지만, 생화학적 접근 방식이 달라 성능 특성에서도 차이가 나타납니다.

예를 들어, 고품질의 CUT&RUN 프로파일의 경우 일반적으로 샘플당 약 300~800만 개의 시퀀싱 read만 필요하므로, 연구자들은 한 번의 실행당 더 많은 libraries를 다중화하여 시퀀싱 비용을 대폭 절감할 수 있습니다. 반면, 일반적인 ChIP-seq 실험에서는 배경 잡음을 제거하고 비슷한 수준의 신호 대 잡음비를 얻기 위해 샘플당 2,000만~4,000만 개의 reads가 필요한 경우가 많기 때문에, CUT&RUN은 다양한 응용 분야에서 더 효율적이고 경제적인 선택지입니다. 시퀀싱 깊이의 감소, 간소화된 워크플로우, 그리고 낮은 입력 요건 덕분에 CUT&RUN은 많은 실험실에서 매력적이고 신속한 선택지로 자리 잡고 있습니다.

그러나 여전히 ChIP-seq이 더 적합한 방법이 될 수 있는 경우도 있습니다. 가장 흔한 한계는 항체의 확보 가능성과 성능 문제인데, 모든 항체가 천연 CUT&RUN 조건에서 제대로 기능하는 것은 아닙니다. 또한, 특정 단백질 표적, 특히 염색질과의 결합이 매우 일시적인 단백질의 경우, ChIP-seq에서 사용되는 교차결합 조건을 활용하면 더 효과적으로 포착할 수 있다.

ChIP-seq, CUT&RUN 및 CUT&TAG의 비교

표 6: ChIC/CUT&RUN 및 ChIP-seq

CUT&RUN에서 약한 가교 결합의 활용

CUT&RUN은 원래 교차결합이 없는 순수 기법으로 고안되었지만, 많은 연구실에서는 취약한 단백질-DNA 상호작용의 유지력을 높이거나 핵 분리 과정에서 쉽게 소실되는 단백질 복합체를 안정화하기 위해 약한 formaldehyde 교차결합을 도입하기 시작했습니다. 이러한 경향은 특히 불안정한 transcription factor, 보조인자 복합체, 또는 과도한 취급을 견디지 못하는 시료 유형이 관련된 응용 분야에서 두드러지게 나타나고 있다.

대부분의 워크플로우에서 가교 반응은 의도적으로 매우 약하게 이루어지며, 이는 ChIP-seq에서 일반적으로 사용되는 수준보다 훨씬 낮은 수준입니다. 일반적인 접근 방식으로는 다음과 같은 것들이 있습니다:

• Brief incubation with 0.1–0.5% formaldehyde
• 짧은 fixation 시간 (1~2분)
• 핵 분리 전 즉시 담금질

이러한 조건은 염색질 결합 단백질의 손실을 방지할 만큼 충분한 안정성을 제공하면서도, 낮은 배경 신호, 높은 분해능, 작은 단편의 효율적인 회수 등 CUT&RUN의 주요 장점을 그대로 유지합니다.

하지만 다음과 같은 중요한 고려 사항이 있습니다:

• 과도한 fixation은 접근성을 저하시켜, MNase의 결합 및 절단 효율을 제한한다.
• 경미한 가교 반응은 신호 획득이 어려운 표적의 경우 신호를 회복시킬 수는 있지만, 완전히 천연 상태의 CUT&RUN에 비해 배경 신호를 증가시킬 수도 있다.
• 이 방법은 fixation 처리를 약하게 진행하더라도 ChIP-seq보다 민감도가 높고 필요한 시료량이 적습니다.

새로운 표적 단백질마다 프로토콜 최적화(fixation 시간, 농도 및 후속 투과화 조건)가 필요한 경우가 많습니다.

자주 묻는 질문

원료로 몇 개의 세포를 사용해야 하나요?

제가 연구하는 모델 생물의 게놈 크기가 인간이나 mouse보다 작은데, 처음부터 세포 수를 늘려야 할까요? 샘플당 세포 수가 50만 개를 초과하는 것은 권장하지 않습니다. 일반적으로 50,000개의 셀을 시작점으로 삼는 것이 좋습니다. ChIP과 달리, ChIC/CUT&RUN은 민감도가 매우 높으며, 시료로 수백만 개의 세포가 필요하지 않습니다. 세포를 너무 많이 사용하면 수율이 떨어질 뿐만 아니라, 무엇보다도 library의 복잡도가 높아집니다.

셀을 더 많이 사용하면, 콘카나발린 A bead의 양도 늘려야 할까요?

실험당 사용되는 세포 수는 500,000개를 초과해서는 안 됩니다. 이 프로토콜에 명시된 bead 수는 50,000~500,000개의 세포 사용에 최적화되어 있으므로, 프로토콜에서 권장하는 bead 수를 늘릴 필요는 없습니다.

ChIC/CUT&RUN 분석에 사용할 수 있도록 세포를 어떻게 냉동 보존해야 하나요?

다음과 같이 사용하는 것이 권장됩니다. 10% DMSO를 적절한 완충액이나 배지에 혼합한 후, Mr. Frosty 이소프로필 알코올 냉동실을 사용하여 서서히 냉동하는 것이 좋습니다. 급속 냉동은 권장하지 않습니다.

ChIP을 위해 세포를 고정하고 냉동 보관해 두었는데, 이 세포를 ChIC/CUT&RUN에 사용할 수 있을까요?

ChIP 시료의 fixation 및 냉동 보존 조건에 따라 가능할 수도 있습니다. 그러나 ChIP 시료의 세포 수가 ChIC/CUT&RUN 시료에 대한 권장치를 초과할 가능성이 높고, 사용된 강력한 fixation 조건(예: 이중 fixation 및 퀘닝)이 MNase 또는 Tn5의 활성을 저해할 것이므로, 표준 프로토콜로는 제대로 작동하지 않을 가능성이 높습니다.

ChIP 시료의 세포 수가 ChIC/CUT&RUN에 권장되는 초기 세포 양을 초과하는 문제는 시료를 여러 부분으로 나누어 처리함으로써 쉽게 해결할 수 있습니다. 그러나 시료의 fixation 및 동결과 관련된 다른 문제들은 여전히 남아 있다. ChIP 프로토콜에 사용되는 fixation 처리는 ChIC/CUT&RUN과 호환되기에는 너무 가혹한 것으로 보입니다. 이는 MNase나 Tn5가 표적 서열을 단편화하거나 태그를 부착하는 능력을 저해할 가능성이 매우 높기 때문이며, 여러 보고서를 통해 이러한 비호환성이 시사된 바 있습니다. 또한, fixation 과정으로 인해 epitope 마스킹이 발생할 가능성이 있습니다. 따라서 시료 fixation 처리는 권장하지 않습니다. ChIC/CUT&Ran을 위해 세포를 극저온 보존할 때는 10% DMSO와 Mr.Frosty 이소프로필 알코올 챔버를 사용하여 시료를 부드럽게 냉동해야 합니다. 대부분의 ChIP 프로토콜에 포함된 급속 냉동은 권장하지 않습니다.

세탁할 때마다 bead들이 뭉쳐요. 제가 뭘 잘못하고 있는 걸까요?

응집 현상은 세포와 bead의 비율이 너무 높거나, 디지토닌이 포함된 lysis buffer에서 핵이나 세포가 용해되어 DNA가 방출됨으로써 발생할 수 있습니다. 가장 먼저 해야 할 일은 권장 셀 수를 초과하지 않았는지 확인하는 것입니다. 또한, fixation 전에 항체와 반응시키기 전에 디지토닌이 포함된 세척 완충액에서 비드 뭉침을 줄이기 위해 formaldehyde(실온에서 0.1% formaldehyde로 2 분 동안 room temperature에서)을 실시하는 것이 권장됩니다. 다만, fixation 처리가 epitope의 가용성에 영향을 미칠 수 있으므로, 각 항체에 대해 별도로 검증해야 한다는 점을 유의해야 합니다.

Primary antibody incubation용 완충액에 EDTA가 포함된 이유는 무엇인가요?

투과화 및 항체 incubation 완충액에 EDTA를 첨가하는 것이 권장되는데, 이는 EDTA가 Mg를 chelate하기 때문이다.^{2+와 킬레이트 결합을 형성하여} 이온과 킬레이트 결합을 형성하여 복제 및 염색질 리모델링을 포함한 ATP 의존성 세포 과정을 차단할 뿐만 아니라, 내인성 DNA 분해효소의 활성도 억제하기 때문입니다.

Protein A/G-MNase나 Protein A-Tn5는 어디서 구할 수 있나요?

두 융합 단백질 모두 처음에는 헤니코프 연구실에서 제공받았습니다. 융합 단백질을 직접 합성하는 방법에 대한 프로토콜이 있다(Kaya-Okur 등, 2019; Meers 등, 2019a)가 있는 반면, 플라스미드인 Protein A-MNase, Protein A/G-MNase 및 Protein A-Tn5는 모두 시약 공급업체에서 상용으로 구입할 수 있다.

다음과 관련하여 대장균 DNA 이월에 관해, 시료 read 수 대비 대장균 read 수의 정상적인 비율은 얼마입니까?

이월량은 초기 세포 수와 항체 epitope의 풍부도에 따라 달라지며, 초기 세포 수와 대장균 DNA에 매핑되는 시퀀싱 리드 수와는 역상관 관계를 보입니다. 이월 현상은 사용된 콘카나발린 A bead의 양에 따라 달라지는데, bead를 많이 사용할수록 대장균의 read 수가 증가합니다. 전반적으로, 다음을 이용한 보정 대장균 이식 DNA를 이용한 보정은 사용된 세포와 bead의 수가 비슷한 실험에만 사용해야 합니다.

참고로, 헤니코프 연구실은 다음과 같은 범위를 보고한 바 있습니다. 대장균 read percentages from 0.01% to 11.5% of the total reads, with IgG samples usually having a higher ratio than other samples 대장균 read (2%에서 11.5%까지)를 나타낸다고 보고했습니다. 또한 연구진은 실험에 수백 개 또는 수천 개의 세포만을 사용할 경우, 대장균(E. coli) 리드의 비율이 약 30%에서 70%. 또한, 시판되는 융합 단백질을 분석한 결과, 전체 read 중 대장균 read로 식별된 비율은 0.01%에 불과했는데, 이는 데이터 정규화에 활용하기에는 너무 적은 수치일 수 있습니다.

시퀀싱을 진행하기 전에 실험의 품질을 통제할 수 있는 방법이 있을까요?

ChIP과 마찬가지로, qPCR을 활용하면 세심하게 설계된 관심 영역을 조사할 수 있다. 반응은 생성된 DNA 단편 풀이 아니라 증폭된 library에서 수행되어야 한다는 점을 유의하십시오. ChIC/CUT&RUN의 경우, 방출된 단편에는 항체 유도형 MNase가 직접 표적으로 삼지 않은 광범위한 게놈 영역이 종종 포함되어 있습니다. 이러한 단편들은 해당 시료로 준비된 library에 포함되지는 않겠지만, qPCR을 통해 증폭될 것입니다. 오탐을 방지하기 위해, qPCR용 템플릿은 증폭된 library여야 하며, 적절한 controls도 함께 수행해야 합니다.

Transcription factor 실험에서 얻은 바이오애널라이저/테이프스테이션 트레이스가 IgG control과 똑같이 보이는데, 제가 뭘 잘못한 걸까요?

좋은 소식입니다. 아마도 여러분은 아무 잘못도 하지 않았을 거예요! positive control 시료(예: H3K27me3)에서 명확한 뉴클레오솜 패턴이 확인되었다면, transcription factor 시료가 제대로 처리되었는지 확인하는 유일한 방법은 시료의 염기서열을 분석하는 것입니다.

안타깝게도, transcription factor library가 IgG library와 매우 유사해 보이는 경우가 꽤 흔하지만, 시퀀싱 후에는 여전히 양질의 데이터 세트를 산출하기도 합니다. 알려진 transcription factor 표적 부위에 대해 IgG library와 transcription factor library의 신호를 비교하기 위해 qPCR 방법을 선택할 수 있습니다.

참고 문헌 및 추가 읽을거리