측정 가능성을 확보하기 위해, 대부분의 flow cytometry 검사에서는 직접적이든 간접적이든 표지자가 포함되어야 합니다. 표지 물질로는 효소, fluorophore 또는 biotin 등이 포함될 수 있다. flow cytometry를 위해 항체를 염색하는 방법에는 여러 가지가 있습니다. 유세포 분석 검사에서 어떤 방법을 사용할지는 세포 유형, 항원 및 flow cytometry 시약에 따라 달라집니다.

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직접 염색 대 간접 염색

In direct immunofluorescence staining, cells are incubated with an antibody that has been conjugated directly to a label (eg FITC). 직접 결합된 항체를 사용하면 항체 배양 단계가 단 한 번만 필요하며, secondary antibody로 인한 비특이적 결합의 가능성을 없앨 수 있습니다.

간접 염색법에서는 표지된 secondary antibody가 primary antibody를 검출합니다. 이 두 번째 시약은 첫 번째 항체에 대한 특이성을 지닌 항체일 수 있다. 또는 아비딘-비오틴 시스템을 사용할 수도 있는데, 이 경우 primary antibody에 biotin이 conjugated되어 있으며, fluorochrome로 labeled된 아비딘을 이용해 검출합니다.

직접 염색 및 간접 염색 프로토콜 모두에서 핵심 단계로는, 신뢰할 수 있는 결과를 확보하고 세포 표면의 특정 항원을 최적으로 검출하기 위한 적절한 flow cytometry 항체 선정, incubation 및 세척이 포함됩니다. 항체의 표적 특이성이 검증된 것은 정확하고 신뢰할 수 있는 flow cytometry 분석 결과를 얻기 위해 필수적입니다. 이는 항체가 의도된 항원에만 결합하도록 보장함으로써 개별 세포 분석에 필요한 신뢰할 수 있는 데이터를 제공하기 때문입니다.

그림 8. Flow cytometry labeling methods: direct and indirect approaches

직접 및 간접 항원 검출법의 장점과 한계

항원 검출을 위한 직접법과 간접법 모두 각각의 장점과 한계가 있다(표 1). flow cytometry 실험에서는 일반적으로 시간을 절약하고 사용이 간편하기 때문에 직접법이 선호됩니다. 이러한 요인들은 다색 실험에서도 적용되지만, secondary antibody를 사용하면 신호 증폭 효과를 얻을 수 있다¹.

표 1. 직접 및 간접 항원 검출 방법의 비교.

요인	직접	간접	댓글
시간	낮음	높음	직접법의 실험 절차는 labeling 단계가 한 번만 필요하기 때문에 대개 더 간단합니다.
비용	높음	낮음	Secondary antibodies are relatively inexpensive compared with conjugated primary antibodies. 또한, 동일한 secondary antibody를 사용하여 다양한 primary antibody를 검출할 수 있습니다.
복잡성	낮음	높음	간접적 방법의 경우 적절한 secondary antibody를 선택하고 추가적인 control군을 설정해야 합니다.
유연성	중간	중간	시중에서 구할 수 있는 사전 접합 primary antibody는 fluorophore와 표적의 조합에 있어 유연성을 제한한다. 그러나 간접적인 방법으로는 한 번에 제한된 수의 항원만 검출할 수 있다.
민감도	낮음	높음	각 primary antibody에는 여러 개의 secondary antibody가 결합하여 신호가 증폭됩니다.
Species cross-reactivity	최소화됨	Potential cross-reactivity between species	Secondary antibodies may cross-react with other species other than the target. Pre-adsorbed secondary antibodies can prevent cross-reactivity.
배경 신호	감소된	가능한 배경	내인성 immunoglobulin이 포함된 검체는 간접 검사법에서 높은 배경 신호를 보일 수 있습니다.

세포 내 염색

flow cytometry를 위한 세포 내 항원 염색 프로토콜은 항체가 세포 내 단백질에 접근할 수 있도록 다양한 fixation 및 투과화 방법을 활용합니다. 이러한 세포 내 단백질의 검출은 일반적으로 fluorescence labeling을 사용한 항체와 다양한 형광 염료를 사용하여 이루어지며, 이를 통해 실험 설계 및 다중 분석에 있어 유연성을 확보할 수 있다. flow cytometry는 세포뿐만 아니라 소포와 같은 다른 입자도 분석하는 데 활용될 수 있어, 다양한 생물학적 대상에 대한 연구를 가능하게 합니다. 염색을 성공적으로 수행하기 위해서는 항체 농도를 단계적으로 조절하여 실험 조건을 최적화하고, 유세포 분석기를 올바르게 설정하기 위한 적절한 control군을 마련하며, fixation 및 투과 절차를 최적화해야 합니다.².

분비 단백질의 검출

분비된 단백질의 검출은 검출 전에 단백질이 세포 밖으로 방출되거나 급속히 분해될 수 있기 때문에 어렵습니다. 브레펠딘 A와 같이 분비를 방해하는 약물은 발현된 단백질을 골지체에 머무르게 함으로써 그 분비를 억제하는 데 사용될 수 있다. 그런 다음 세포 내 염색법을 사용하여 표적 단백질을 검출할 수 있다.

Fluorophores 이해하기

Fluorophores(fluorochrome라고도 함)는 flow cytometry에서 검출에 있어 매우 중요한 역할을 합니다. flow cytometry에 사용할 수 있는 다양한 fluorescence 염료가 있으며, 각각 고유한 분광적 특성을 지니고 있어 다중 분석이 가능하고 실험 설계에 유연성을 부여합니다. fluorophore 의 특성을 이해하는 것은 다색 실험에서 fluorescence spillover를 보정하는 데 중요합니다. 레이저 선과 채널 호환성을 분석할 때는 에 정렬된 fluorochrome emission 스펙트럼 차트 를 참조하십시오." Fluorophores are commonly used as fluorescence detection reagents in flow cytometry, together with antibodies. 이들은 특정 파장 범위 내에서 빛을 흡수하고 방출하며, 이를 일반적으로 흡광도(여기)와 발광도( emission 스펙트럼 )라고 부릅니다(그림 9)3 .

그림 9. Fluorophore의 여기 및 방출

Flow cytometry용 tandem-dye 염료

다색 패널을 설계할 때는 종종 서로 다른 두 개의 fluorophore가 공유결합으로 연결된 tandem-dye 염료가 필요합니다. 한 fluorophore(도너)은 특정 레이저 파장에서 여기되는 반면, 다른 fluorophore는 다른 파장의 빛을 방출합니다. 예를 들어, phycoerythrin-Cy7(PE-Cy7)에서 PE와 Cy7은 각각 도너 fluorophore와 어셉터 fluorophore 역할을 한다. 따라서 PE-Cy7은 PE의 여기 특성과 Cy7의 발광 특성을 모두 갖게 될 것이다(그림 10).⁴

그림 10. tandem-dye 염료의 여기 및 발광.

Tandem-dye 염료는 단일 레이저로 여러 fluorophore를 여기시키고 서로 다른 검출기로 측정할 수 있기 때문에 패널 크기와 유연성을 높여줍니다. 예를 들어, Alexa Fluor® 488, PE, PerCP-Cy5.5 및 PE-Cy7은 청색 레이저(488 nm)에 의해 여기될 수 있습니다. 그러나 이 장치들은 녹색, 노란색, 보라색 및 적외선 방출을 발생시킬 것이다(그림 11).

그림 11. 다양한 tandem-dye 염료의 여기 및 방출 스펙트럼.

tandem-dye 취급을 위한 요령과 팁

Tandem-dye는 광표백에 매우 취약하므로 항상 빛으로부터 보호해야 합니다.
Tandem-dye antibody conjugates should not be frozen. Freezing may result in denaturation of the donor fluorophore.
시료의 밝기를 떨어뜨릴 수 있으므로, 시료 fixation이나 투과 처리는 가능한 한 최소화하십시오.
배치 간 변동성이 크기 때문에 각 배치마다 최적화가 필요합니다.
FRET 효율이 결코 100%에 달하지 않기 때문에, 기증자 측에서 약간의 블리드스루 방출이 관찰될 수 있습니다. 100%
Tandem-dye의 분해나 결합 해체를 방지하기 위해 4°C에서 세포에 표지하십시오.

Flow cytometry analysis: selecting a fluorophore conjugate

flow cytometry에서 항체가 양성 신호와 음성 신호를 구별해 내는 능력은 종종 사용된 fluorophore에 따라 달라집니다. 종, 아류, isotype, 표지 물질 등의 요소를 고려하여 secondary antibody 및 fluorophore conjugate에 대해 이용 가능한 옵션을 검토하는 것이 중요합니다. 실험을 계획할 때는 최적의 결과를 얻을 수 있도록 구체적인 실험 요건에 따라 적절한 fluorophore conjugate를 선택해야 합니다.

표 2 는 다양한 일반적인 fluorophore의 특성에 대한 일반적인 안내입니다. 또한, 사용된 flow cytometry 항체의 종류에 따라 각 fluorophore의 상대적 강도에는 약간의 차이가 있습니다.

표 2. Flow cytometry에 사용되는 일반적인 fluorophore의 특성

fluorophore	여기 파장 (nm)	방출 파장 (nm)	상대적 밝기	참고 사항
phycoerythrin (PE)	565	575	5	단백질 기반, 매우 밝은
allophycocyanin (APC)	645	660	5	단백질 기반, 매우 밝은
Alexa Fluor 647®	650	668	5	APC와 유사하지만, 세포 내 염색에 더 적합한 소분자입니다.
PE-시아닌 7 (PE-Cy7)	496, 565	774	4	탠덤-dye, 염료, 빛에 매우 민감함
PE-시아닌 5 (PE-Cy5)	496, 565	670	4	tandem-dye로, APC와 함께 사용하기에는 적합하지 않습니다.
Alexa Fluor 488®	495	519	3	FITC와 유사하지만 더 안정적이고 발광 강도가 더 높음
Alexa Fluor 700®	696	719	2	풍부하게 존재하는 항원에 labeling을 수행하는 데 유용합니다.
FITC	494	520	2	pH 변화와 광표백에 민감하다.
APC-Cy7	650	774	2	tandem-dye 염료로, PE-Cy7과 함께 사용하기에는 적합하지 않습니다.
퍼시픽 블루	410	455	1	풍부하게 존재하는 항원에 labeling을 수행하는 데 유용합니다.