blocking은 시료 준비 후에, 하지만 대개는 primary antibody를 이용한 incubation 전에 실시합니다. IHC에서는 항체가 특정 항원을 인식하므로 blocking 과정을 통해 비특이적 결합을 방지합니다. 이 단계를 생략하면 primary antibody가 여러 부위와 결합하여 위양성 결과를 초래할 수 있습니다.

IHC 응용 분야 가이드

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IHC의 단백질 blocking

혈청은 비특이적 부위와 결합하는 항체를 함유하고 있기 때문에 흔히 사용되는 단백질 차단제입니다. 최상의 결과를 얻으려면 secondary antibody의 종에 부합하는 혈청을 사용하세요. 이렇게 하면 비특이적 결합 부위가 발견되는 것을 방지할 수 있습니다(그림 2). 서로 다른 종의 secondary antibody를 사용하여 여러 차례 염색을 실시하는 경우, 두 secondary antibody의 종에 해당하는 blocking 혈청을 사용해야 할 수도 있습니다.

그 밖에도 흔히 사용되는 단백질 blocking 시약으로는 bovine serum albumin(BSA), 그리고 무지방 분유에서 추출한 casein이 있습니다. 대개 효능이나 유통기한이 최적화되도록 배합되는 사전 배합 blocking 버퍼도 시중에 판매되고 있습니다. 이 방법들은 secondary antibody의 종에 부합할 필요가 없습니다.

그림 2. primary antibody 및 secondary antibody를 이용한 특이적/비특이적 결합 부위 검출.

mouse 조직에 대한 mouse 항체 사용

mouse 조직에 mouse primary antibody를 사용할 때는 각별히 주의해야만 합니다. 항mouse secondary antibody가 내인성 mouse IgG 및 Fc 수용체와 결합함에 따라 높은 배경 염색이 발생할 수 있습니다. 이 배경 결합은 당사의 mouse-on-mouse 프로토콜에 설명된 대로 F(ab) 단편을 사용하여 줄일 수 있으며, blocking 단편과 사용할 secondary antibody를 신중하게 일치시키는 것이 중요합니다.

IHC의 autofluorescence 감소 작업

형광 표지를 검출에 사용하는 경우, 해당 조직이 자가형광 상태인지 확인하세요. 자가형광 조직은 위양성 결과와 높은 배경 신호를 유발할 수 있습니다. autofluorescence의 원인은 fixation 방법, 형광 화합물 등등 여러 가지입니다. 그러나 내인성 autofluorescence를 차단할 수 없다면 색소 검출 시스템을 사용하는 것이 더 나을 수 있습니다.

autofluorescence의 원인과 감소 방법:

조직 고정(tissue fixation)을 실시하는 경우, 특히 아민과 반응하여 형광 산물을 생성하는 알데하이드 고정액(예: 포르말린)을 사용하는 경우. 이때 발생하는 autofluorescence는 다음과 같은 방법으로 줄일 수 있습니다.
1. 비알데하이드 고정액(예: Carnoy 용액)을 사용하세요.
2. 시료에 sodium borohydride 또는 glycine/lysine을 투여해서 알데히드를 차단하세요.
3. 냉동 조직 절편을 사용하세요.
4. 조직에 pontamine sky blue, Sudan black, trypan blue 또는 FITC 블록 등의 소광 염료를 투여하세요.
플라빈 및 포르피린과 같은 형광 화합물. 이 화합물의 효과는 다음과 같은 방법으로 저하시킬 수 있습니다.
1. 고정 및 탈수 절편을 만들 때 사용하는 용매로 이 화합물을 조직에서 추출하세요. 단, 수성 시약을 사용하여 처리된 냉동 절편에는 이 화합물이 계속 남아 있습니다.

내인성 효소 blocking

발색 검출 과정에서는 효소를 이용하여 타겟 항원을 시각화합니다. 따라서 검출 전에 내인성 효소를 차단해야 합니다.

biotin blocking

biotin 기반 검출 시스템을 사용한다면 내인성 biotin을 차단하시는 것이 좋습니다. 먼저 시료에 과량의 avidin을 첨가하여 자연적으로 존재하는 biotin과 결합시킵니다. 이어서 과량의 biotin을 넣어 배양함으로써 avidin 분자의 추가 결합 부위를 차단합니다.

신장, 간, 뇌와 같이 내인성 biotin의 함량이 높은 시료의 경우에는 polymer 기반 방법을 사용해 보세요. polymer 방법은 다수의 효소 분자 및 secondary antibody가 결합된 dextran 골격을 사용합니다.

peroxidase blocking

신장, 간, 그리고 적혈구가 함유된 조직(예: 혈관 조직)을 비롯한 일부 조직에는 내인성 peroxidase가 함유되어 있습니다. 관심 대상 단백질을 관찰하기 위해 horseradish peroxidase(HRP)를 사용하는 경우, 시료를 3,3'-diaminobenzidine(DAB) 기질에 넣어 배양해서 내인성 peroxidase의 활성 유무를 확인하세요. 시료가 갈색으로 변하면 내인성 peroxidase가 존재하는 것이므로 blocking 단계가 필요합니다. 보통 0.3% hydrogen peroxide에 넣어 10~15분간 배양하면 blocking 처리가 충분히 된 것입니다.

alkaline phosphatase blocking

Endogenous alkaline phosphatase(AP)는 신장, 장, 골모세포, 림프조직 및 태반에서 발견되며, 대체로 냉동 조직에서 더 높은 활성을 보입니다.

검출 시 AP를 사용하는 경우, BCIP/NBT 용액으로 배양해서 시료에 내인성 AP가 함유되어 있는지 확인하세요. 시료가 파란색으로 변하면 내인성 AP가 존재하는 것이므로 blocking 단계가 필요합니다. Blocking은 levamisole hydrochloride 또는 tetramisole hydrochloride와 같은 alkaline phosphatase inhibitor로 배양함으로써 이루어집니다.