Question (43182) | Anti-mtTFA antibody [18G102B2E11] - Mitochondrial Marker (ab119684)

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Question

1) Code du produit Abcam ab119684

2) Numéro de commande Abcam ou le numéro de lot/batch xx Description du problème Bande située à 29Kda au lieu des 20KDa indiqués

4) Préparation de l’échantillon :

Type d’échantillon (lysat cellulaire, fraction, protéine recombinante …) :

Tampon de lyse 50mM TRISHCL / 150mM NaCl / 0.5% NP / 0.25% Sodium Deoxycolate / 0.1% SDS

Inhibiteurs de protéases 1mM PMSF + Complete mini 1X (Roche 11836153001)

Inhibiteurs de phosphatases NON

Agent réductant Laemli 1X final

95oC pendant ≥5 min? oui/non OUI

Protéine/puits en mg ou nombre de cellules/puits 25µg

Contrôle positif NON

Contrôle négatifxx

5) Pourcentage du gel Stacking: 4% / Separating: 12%

Type de membrane PVDF

Vérification du transfert NON

Tampon de saturation et concentration Lait 5% en TBS-Twenn

Temps d’incubation de la saturation 1 Heure

Température de saturation Température ambiante (environ 24°c)

6 Anticorps primaire (utilisation de plusieurs anticorps, description dans “notes supplémentaires”) :

Concentration ou dilution 1/1000

Tampon diluant TBS-Tween + 0.1% lait

Temps d’incubation 1 Heure

Température Incubation Température ambiante (environ 24°c)

7) Anticorps secondaire :

Espèce

Réagit contre Mouse

Concentration ou dilution 1/15000

Tampon de dilution TBS-Tween

Temps d’incubation 1 Heure

Température d’incubation Température ambiante (environ 24°c)

Fluorochrome or enzyme conjuguée Peroxydase

8) Lavage après les anticorps primaire et secondaire :

Tampon TBS-Tween

Nombre de lavage 3 fois

Temps d’incubation du lavage 5 minutes

9) Méthode de détection: ECL + (Ge Healthcare RPN 2132)

10) Combien de fois avez vous essayer ce Western Blot ? environ 6 fois

Obtenez-vous toujours le même résultat ? OUI

Quelle étape avez vous optimisée ?

Aucune, car, même si elle n’est pas située au poids apparent attendu, c’est la seule bande apparaissant sur le film…

Answer

Merci d'avoir pris le temps de remplir notre questionnaire et de nous avoir contactés. Je suis désolée que vous avez des problèmes avec l'interprétation de deux de nos anticorps.

Comme expliqué auparavant, notre politique est d'offrir tout d'abord la meilleure assistance technique. Si jamais nous concluons que le produit que vous avez reçu ne fonctionne pas comme mentionné sur sa fiche technique et que ce produit a été commandé sous 180 jours, nous nous ferons un plaisir de vous offrir un remplacement gratuit ou un avoir en compensation.

J'aimerais donc vous offrir quelques suggestions afin d'optimiser vos résultats. J'apprécierais si vous pouviez confirmer quelques détails de la procédure.

1.) Comme écrit dans mon premier émail, est-ce que vous avez vérifié que le tampon du migration est compatible/adapté au marquer de poids? Effectivement, suivant le tampon, l'échelle dans le tampon peux varier beaucoup. Pour illustration, je peux vous recommander de voir l'image comparative d'un de nos marqueurs en différents tampons: Click here (or use the following: https://www.abcam.com/index.html?datasheet=115832).

2.) Il existent deux isoformes du mtTFA. Celles-ci sont décrites dans la base de données SwissProt chez la souris: http://www.uniprot.org/uniprot/P40630 La deuxième isoforme a un poids moléculaire attendu de 25kD et est appelé isoforme nucléaire.

3.) Je peux vous conseiller de tester des autres cellules, comme les cellules Hela, en parallèle comme test. Ceci afin d'exclure que dans les fibroblastes une nouvelle isoforme soit exprimé.

4.) Est-ce que vous pouvez confirmer aussi que vous avez utilisé des extrait totaux?

J'espère que ces informations vous aideront. Si nos suggestions ne permettent pas d'améliorer vos résultats, n'hésitez pas à me recontacter pour plus d'assistance.

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