pan Caspase (active) FITC Staining Kit (ab65611)

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Overview

  • Product name

    pan Caspase (active) FITC Staining Kit
    See all Caspase kits

  • Sample type

    Adherent cells, Suspension cells

  • Assay type

    Enzyme activity

  • Assay time

    2h 00m

  • Product overview

    Abcam's Fluorescein Caspase Staining Kit provides a convenient and sensitive means for detecting activated caspases in living cells. The assay utilizes the caspase family inhibitor VAD-FMK conjugated to FITC (FITC-VAD-FMK) as a marker. FITC-VAD-FMK is cell permeable, nontoxic, and irreversibly binds to activated caspases in apoptotic cells.
    Visit our FAQs page for tips and troubleshooting.

  • Notes

    Activation of caspases plays a central role in apoptosis.

    Other caspase and apoptosis assays

    Review the full set of caspase assays, or the apoptosis assay and apoptosis marker guide.

  • Platform

    Flow cytometer, Fluorescence microscope

Properties

  • Storage instructions

    Store at -20°C. Please refer to protocols.
  • Components 100 tests
    FITC-VAD-FMK 1 x 100µl
    Wash Buffer 2 x 100ml
    Z-VAD-FMK 1 x 10µl

  • Research areas

  • Relevance

    Caspases are members of the cysteine-aspartic acid protease (caspase) family. Sequential activation of caspases plays a central role in the execution-phase of cell apoptosis. Caspases exist as inactive proenzymes which undergo proteolytic processing at conserved aspartic residues to produce 2 subunits, large and small, that dimerize to form the active enzyme.

  • Cellular localization

    Cytoplasmic

References (0)

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ab65611 has not yet been referenced specifically in any publications.

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Question

Estimada ,
Muchas gracias por la ayuda. Teniendo en cuenta tus comentarios, estamos interesados en realizar la tinción para detectar caspasa-3, nosotros contamos con el microscopio de fluorescencia pero no tenemos los anticuerpos, ni la solución de bloqueo, por lo cual aceptamos tu colaboración, ojalá lo antes posible pues es de gran urgencia terminar estas pruebas. Quedamos pendiente de tus comentarios.

Saludos,

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Answer

Gracias por tu respuesta.

Me alegra saber que estas interesada en probar la presencia de caspasa 3 en tus células.

Nosotros podemos mandarte como algo excepcional un anticuerpo gratuito contra Caspasa 3, el ab2302. Normalmente son los usuarios los que tienen que determinar la presencia de antígeno en sus muestras, pero ya le digo que como algo un poco especial, puedo mandarle de forma gratuita el anticuerpo primario.

En nuestro catálogo encontrará anticuerpos secundarios compatibles (dígame si necesita ayuda para encontrar uno especifico), y soluciones de bloqueo para llevar a cabo el ensayo, pero me temo que estos reactivos no me permiten facilitárselos de forma gratuita, tendría usted que abonarlos. Alternativamente podría hacerle un descuento del 50% en la compra del anticuerpo primario + el secundario.

Si no le interesa esta opción, puede tratar de determinar la presencia de caspasa en sus muestras por otros medios. Lo importante es que averigüemos si el kit no detecta la proteína debido a un problema en el tratamiento de las muestras, o por otras razones. En estos casos donde el protocolo del kit es tan directo, normalmente los problemas residen en el tratamiento de las muestras.

Puede echar también un vistazo a nuestros protocolos en la web sobre apoptosis, quizás le sirvan de ayuda para inducir apoptosis en sus células por otros medios y verificar la presencia de enzimas.

https://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11370

https://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11368

Dígame como quiere que procedamos para intentar solucionar este problema. Quedo a su disposición si necesita información adicional.

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Question

Cordial saludo,


Me permito muy amablemente solicitar su apoyo en la interpretación de los resultados de la aplicación del Kit para detección de caspasas AB65611 comprado en Colombia a la empresa Genproducts. Esto debido a que se han realizado dos ensayos con células murinas y humanas siguiendo las instrucciones del kit, sin obtener resultados comprensibles. En ese sentido adjunto les envío los resultados en formado .pdf y .fcs para que ustedes me puedan indicar si estamos analizando mal los datos o si consideran puede haber un error en la metodología de uso. Los ensayos se adelantaron de la siguiente manera:



1. Determinación de caspasas en fibroblastos murinos L929

Se sembraron 10.000 células/pozo (0,2mL) con una viabilidad del 95%. Las células fueron tratadas con tres concentraciones de extracto de PP y cuatro concentraciones de taxol durante 72 h a 37°C y 5%CO2. A la vez se sembró un control de células sin tratar y un control de células con inhibidorZ- VAD- FMK.Posteriormente las células fueron recuperadas en tubos de citometría y adicionadas con 0,5 microlitro deFITC-VAD-FMK en cada tubo, e incubados durante 45 minutos a37°C y 5%CO2. Luego las células fueron centrifugadas a 3000 rpm por 5 minutos, se removió el sobrenadante y se resuspendieron en 0,3 mL de Buffer y centrifugadas y lavadas de nuevo. Las células resuspendidas en0,3 mL de Buffer fueron analizadas en un citometro deflujo Fas Cantousando el canal FL-1,

2.Determinación de caspasas enlinfocitos

Se sembraron 500.000 células/pozo (0,2mL) obtenidas a partir de sangre periférica con una viabilidad del 98%. Las células fueron tratadas con cuatro concentraciones de taxol durante 24 h a 37°C y 5%CO 2. A la vez se sembró un control de células sin tratar y un control de células con inhibidorZ- VAD- FMK.Posteriormente las células fueron recuperadas en tubos de citometría y adicionadas con 1 microlitro deFITC-VAD-FMK en cada tubo, e incubados durante 45 minutos a37°C y 5%CO2. Luego las células fueron centrifugadas a 3000 rpm por 5 minutos, se removió el sobrenadante y se resuspendieron en 0,3 mL de Buffer y centrifugadas y lavadas de nuevo. Las células resuspendidas en0,3 mL de Buffer fueron analizadas en un citometro de flujo Fas Canto, usando el canal FL-1, previa adición de 7AAD para la determinación de células viables.
Quedo pendiente de sus amables comentarios y recomendaciones y de antemano agradezco su colaboración.

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Answer

Gracias por enviarnos de nuevo los resultados obtenidos.

He estudiado el protocolo seguido y los resultados enviados, y me gustaría, antes de determinar que el kit estaba defectuoso, proponerle que lleven a cabo un ensayo para confirmar que el tratamiento seguido para inducir apoptosis en las células es el adecuado, y por tanto hay presencia de caspasas en las células para ser detectadas por el kit.

Si tienen un método para comprobar que realmente se ha inducido apoptosis, le animo a que lo pruebe, y comparta el resultado con nosotros.

En caso de que no tenga manera de llevar a cabo esta determinación, le puedo proponer una pequeña prueba. Si le parece, le propongo que lleve a cabo una tinción celular, una inmunofluorescencia con las células, para detectar la presencia de caspasa 3 en ellas. Esta caspasa es la más común en células que sufren apoptosis, por lo que si el tratamiento que ha llevado a cabo con sus células fue el adecuado, entonces el anticuerpo anti-Caspasa 3 deberá detectarlo.

Si tienen ustedes los medios para llevar a cabo una inmunofluorescencia con sus células, indíquemelo, y le mandaré un anticuerpo de forma gratuita para que lo pruebe y determine la presencia (o ausencia) de la proteína. Asegúrese de que tiene el anticuerpo secundario para ejecutar el experimento.

Puede ver los detalles del anticuerpo primario que le comento en su datasheet:

https://www.abcam.com/active-Caspase-3-antibody-ab2302.html

Le mando el link al protocolo que tenemos en nuestra web para llevar a cabo ICC/IF, por si no tuvieran experiencia previa:

https://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11417

Así pues, si está interesada, le envío el anticuerpo, usted realiza el staining sobre las mismas muestras que ha usado con el kit (aquellas que han sido tratadas con extracto PP y taxol), y nos remite los resultados y las imágenes obtenidas. Es importante que me indique si tiene los medios para llevar a cabo el ensayo (anticuerpo secundario, microscopio de fluorescencia, solución de bloqueo, etc…).

Si el anticuerpo detecta la presencia de caspasa 3 en las células, es posible que el problema provenga entonces del kit, pero antes hay que comprobarlo. Espero entonces su respuesta para que me indique como proceder, y quedo a su disposición por si tuviera cualquier otra consulta.

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Question

Buenas tardes,   Me permito muy amablemente solicitar información referente al Kit para detección de caspasas AB65611 1. Se puede utilizar en líneas celulares murinas y humanas? 2. Es necesario permeabilizar las células antes de realizar el ensayo? 3. Nosotros vamos a realizar el análisis por citometría de flujo. Existe alguna indicación para la interpretación de los datos? 4. Este kit detecta todas las caspasas activas o solo algunas específicas?   Quedo pendiente de sus amables comentarios.   Gracias.

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Answer

Muchas gracias por contactarnos. Encontrará sus respuestas a continuación: ¿Se puede utilizar en líneas celulares murinas y humanas? Este kit es compatible con muestras de mamíferos, por lo que es válida para su uso en muestras precedentes de humano y de ratón. ¿Es necesario permeabilizar las células antes de realizar el ensayo? No es necesario llevar a cabo la permeabilización de las células. Nosotros vamos a realizar el análisis por citometría de flujo. ¿Existe alguna indicación para la interpretación de los datos? Los resultados se interpretan comparándolos con la muestra control no inducida. Las siguientes publicaciones hacen referencia a este kit y quizas puedan resultar de ayuda: Abdel-Latif, L. et al. (2006) J. Gen Virol. 87: 2539-2548. Alajiz N et al (2008) Clin. Cancer Res. 14: 4891-4897. Bahl, K. et al. (2006) J. Immunol. 176: 4284-4295. Cho SH et al (2009) Blood; 10.1182/blood-2008-03-144121. Magari, M. et. al. IL-21–Dependent B Cell Death Driven by Prostaglandin E2, a Product Secreted from Follicular Dendritic Cells. J. Immunol., Oct 2011; 187: 4210 - 4218. Ohshima, S. (2006) Ann. N.Y. Acad. Sci. 1067: 228-234. William, J., et al. (2005) J. Immunol. 174: 6879-6887. Yagi T et al. (2008) PNAS 105: 979 - 984. Zhang, T. et al. The Pleckstrin Homology Domain Adaptor Protein Bam32/DAPP1 Is Required for Germinal Center Progression. J. Immunol. 2010; 184: 164-172.   ¿Este kit detecta todas las caspasas activas o solo algunas específicas? Este kit detecta principalmente Pan-Caspasa. Tenemos otros kits en el catálogo que detectan caspasas específicas. Si necesitas más información al respecto, estaré encantada de poder ayudar.   Espero que esta información sea de utilidad. Si tiene cualquier otra consulta, por favor, no dude en consultarnos.

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