Anti-mtTFA antibody [18G102B2E11] - Mitochondrial Marker (ab119684)

Upon reviewing your protocol, it is troubling to me that all 4 of these antibodies are not working. While it is conceivable that all four antibodies are not performing properly, typically when multiple antibodies are not working it is an issue with sample preparation, membrane transfer, or the detection substrate. In your case, I think the following troubleshooting steps are the most worth your while attempting, with tip 1 being the first thing you try since it is the most likely to make the targets recognizable by the antibodies:
1. You mentioned your samples were non-denatured. ab2571, ab32124, and ab81212 were all raised against synthetic peptides and will require linear proteins in order to recognize their epitopes. Thus, your samples should be both reduced and denatured (SDS and beta-mercaptoethanol or DTT) and boiled for 5 minutes at 100C prior to freezing at -20C. RIPA buffer is a good choice for mitochondrial and membrane proteins such as these.
2. To enrich the target proteins, have you considered a mitochondria isolation kit such as ab110170 (https://www.abcam.com/Mitochondria-Isolation-Kit-for-Cultured-Cells-ab110170.html)?
3. Have you insured that the proteins are being transferred with a reversible stain such as Ponceau S? Since you are using PVDF, make sure to pre-soak the membrane in MeOH, then in transfer buffer.
4. If you are including milk in your antibody dilutions try removing milk or reducing to 0.5% milk for the antibody dilutions only.
Further troubleshooting tips, including no signal specific tips, are included through the link below:
https://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=11352
Please let me know the results of troubleshooting, especially step 1. I look forward to your reply and sincerely hope this information helps.

Merci d'avoir pris le temps de remplir notre questionnaire et de nous avoir contactés. Je suis désolée que vous avez des problèmes avec l'interprétation de deux de nos anticorps.

Comme expliqué auparavant, notre politique est d'offrir tout d'abord la meilleure assistance technique. Si jamais nous concluons que le produit que vous avez reçu ne fonctionne pas comme mentionné sur sa fiche technique et que ce produit a été commandé sous 180 jours, nous nous ferons un plaisir de vous offrir un remplacement gratuit ou un avoir en compensation.

J'aimerais donc vous offrir quelques suggestions afin d'optimiser vos résultats. J'apprécierais si vous pouviez confirmer quelques détails de la procédure.

1.) Comme écrit dans mon premier émail, est-ce que vous avez vérifié que le tampon du migration est compatible/adapté au marquer de poids? Effectivement, suivant le tampon, l'échelle dans le tampon peux varier beaucoup. Pour illustration, je peux vous recommander de voir l'image comparative d'un de nos marqueurs en différents tampons: Click here (or use the following: https://www.abcam.com/Prestained-Protein-Ladder-Mid-range-molecular-weight-10-175-kDa-ab115832.html).

2.) Il existent deux isoformes du mtTFA. Celles-ci sont décrites dans la base de données SwissProt chez la souris: http://www.uniprot.org/uniprot/P40630 La deuxième isoforme a un poids moléculaire attendu de 25kD et est appelé isoforme nucléaire.

3.) Je peux vous conseiller de tester des autres cellules, comme les cellules Hela, en parallèle comme test. Ceci afin d'exclure que dans les fibroblastes une nouvelle isoforme soit exprimé.

4.) Est-ce que vous pouvez confirmer aussi que vous avez utilisé des extrait totaux?

J'espère que ces informations vous aideront. Si nos suggestions ne permettent pas d'améliorer vos résultats, n'hésitez pas à me recontacter pour plus d'assistance.

Je suis désolée d'apprendre que ces anticorps ne vous donnent pas de résultats satisfaisants en Western blot - c.à.d. une bande à environ 42kD pour SURF1 et à environ 24kD pour mtTFA).
Nous n'avons pas eu des autres retours négatives et n'avons pas non plus eu des indications autres d'un problème avec ces anticorps. Nous n'avons pas non plus eu des feedback autres des gens utilisant ces anticorps sur des cellules similaires.
Comme la qualité de nos produits est très imporante pour nous, nous aimerions bien investiguer en plus de profondeur le problème que vous avez avec ces anticorps. Veuillez pour ceci nous fournir un peu plus d'information s'il vous plaît. Pour ceci je vous ai joint un questionnaire qui nous permet de regrouper le plus d'informations possible sur le protocole que vous avez utilisé avec cet anticorps..
En regardant les informations que vous nous aviez déjà envoyé, j'aimerai bien noter les points suivants:
1.) Est-ce que vous avez vérifié que le tampon du migration est compatible/adapté au marquer de poids? Effectivement, suivant le tampon, l'échelle dans le tampon peux varier beaucoup. Pour illustration, je peux vous recommander de voir l'image comparative d'un de nos marqueurs en différents tampons: Click here (or use the following: https://www.abcam.com/Prestained-Protein-Ladder-Mid-range-molecular-weight-10-175-kDa-ab115832.html).
2.) Il existent deux isoformes du mtTFA. Celles-ci sont décrites dans la base de données SwissProt chez la souris: http://www.uniprot.org/uniprot/P40630 La deuxième isoforme a un poids moléculaire attendu de 25kD et est appelé isoforme nucléaire.
Je me réjouis de recevoir votre réponse avec les informations additionnelles afin de pouvoir continuer à investiguer ce problème.
Si nous concluons que notre produit est fautif et ne fonctionne pas comme explicité par notre fiche technique, nous serons ravis de mettre en place l'envoi d'un tube de remplacement gratuit ou d'un remboursement (sous réserve d'une commande ultérieure de 180 jours).