Question (68865) | Rat IL-1 beta ELISA Kit (ab100767)

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Question

Apreciada
Te adjunto más abajo en color rojo las respuestas a vuestros comentarios.
Un saludo
- Ambos kits se pidieron en Junio, si no se han utilizado hasta ahora es posible que haya habido degradación de los reactivos del mismo si no se ha almacenado a la temperatura adecuada. ¿Puedes confirmarme como se ha almacenado el kit, y el vial de estándar después de su reconstitución? ¿Estaba abierta la placa durante tiempo antes de utilizarse?
-Los kits se almacenaron a su llegada en la cámara fría a 4ºC. Las cajas no se desprecintaron hasta el día en que se realizó el kit. El estándar se reconstituyó en el momento de realizar el kit, por lo que no fue necesario almacenarlo. La placa estaba cerrada, ya que como he comentado anteriormente, el kit no se desprecintó hasta el momento de realizar el ensayo.
- Por el protocolo enviado entiendo que las muestras de suero no se diluyeron. Nosotros recomendamos una dilución mínima de 1/2 para muestras de suero o plasma. Si no se diluyen las muestras existe el riesgo de observar efecto matriz (este efecto ocurre cuando alguno de los compuestos de la muestra afectan a la immuno reactividad de la molécula target, enmascarando los sitios de unión). Algunos posibles causantes de ello son los anticuerpos propios, proteínas de unión, albumina etc… El resultado es que la muestra puede dar una lectura falsa, por encima o por debajo de los valores adecuados en un test ELISA, o incluso dar una respuesta no lineal.
Incluso en algunos casos algunas enfermedades contribuyen a crear el efecto matriz alterando las propiedades de la sangre. Este efecto es difícil de predecir y de solucionar.
Por ello no solemos recomendar usar muestras de plasma o suero sin diluir, para evitar este efecto. El factor de dilución mínimo recomendado es 1/2, incluso para la detección de citoquinas poco abundantes como IL1 beta e IL6.
-A pesar de que en los datos que os envié no se observa, las muestras de suero si estaban diluidas a 1/3.
-También sugeriría incubar el anticuerpo por más tiempo. Al menos 2.5 horas, pero lo ideal es dejarlo actuar durante la noche para incrementar la señal.
-Las muestras fueron incubadas durante toda la noche a 4ºC en agitación suave.
Si te parece y estás de acuerdo te propongo ensayar los cambios sugeridos y observar si la señal aumenta. En caso contrario, ya que ambos kits están cubiertos por la garantía Abpromise, se te reemplazarían los kits o reembolsaría el importe de los mismos.
-Debido a que se trataba de muestras de suero de ratas, disponíamos de muy poca muestra, por lo que actualmente nos es imposible volver a analizar las muestras. Por esta razón propongo que nos rembolséis el importe de los dos kits. En un futuro, cuando volvamos a generar muestras, adquiriremos nuevos kits.

Answer

Perdona por la espera.
Es muy posible que el motivo de la baja absorbancia observada en las placas se deba a la perdida de actividad de alguno de los componentes del kit, debido a su degradación por haberse mantenido durante tantos meses a 4C.
Siempre recomendamos adquirir los productos, especialmente los kits de actividad, cuando vayan a utilizarse. Si se almacenan durante más de un mes es aconsejable mantenerlos a -20C para evitar posibles pérdidas de actividad.
La señal del estándar para el kit de IL6 es baja, sin embargo para el kit IL1beta los valores son aceptables. En este último caso el problema es quizás el background, que provoca la perdida de sensibilidad de la recta del estándar. Adjunto un par de documentos con algunos consejos para obtener señales intensas del estándar en las placas y para disminuir el grado de background.
De todas formas, el problema más común en experimentos de determinación de IL6 e IL1beta, no tiene que ver con el ensayo en sí, sino simplemente con los bajos valores de estas citoquinas.
En suero y plasma estas se encuentran en niveles bajos normalmente. Sin embargo, hay ciertos parámetros que deben mantenerse en estos ensayos para maximizar la probabilidad de que las muestras se encuentren dentro del rango detectable del ensayo:
- Incubar muestras y estándar durante la noche a 4C.
- Incrementar la cantidad de anticuerpo de detección (en 1,5. Demasiado incremento provocaría background)
-Incrementar la cantidad de HRP Streptavidina (de nuevo en 1,5 para evitar la aparición de background)
- Concentrar las muestras (usando, por ejemplo, una columna).
Se recomienda usar cada una de estas modificaciones por separado para evitar de nuevo la aparición de background.
De todas formas dado que ambos kits se encuentran en garantía si deseáis recibir un reembolso o reemplazo no dudes en comunicármelo.
Espero que esta información sea útil. Espero tu respuesta al respecto.

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