The lab adviced the following:

While serum and plasma samples maybe run undiluted, we do not usually recommend doing so. The reason is not because Assay Diluent A needs to be present in every sample but that testing undiluted serum/plasma samples increases the risk of experiencing matrix effects.


Matrix effects occur when some component of the sample affects immunoreactivity of the target molecule, possibly by sequestering binding sites. Auto-antibodies, binding proteins, albumin, etc. may be possible culprits, but it’s hard to say for sure. The result is that the sample may read falsely high or low in the ELISA test, or may give a non-linear dilution response. Sometimes certain disease states contribute to matrix effects by altering the properties of the blood (highly lipemic samples, for instance); hemolysis may also cause similar problems. Matrix effects can be hard to predict and challenging to overcome.


For this reason, we rarely recommend running plasma or serum samples undiluted, as matrix effects are more likely to occur. The lowest dilution factor we normally recommend starting with is 2-fold, even for the low-abundance cytokines. If the customer is concerned that their sample levels will be below detection, keep in mind the optional overnight standard/sample incubation can be performed to try and maximize the absorbances. If that doesn’t work, the customer may want to consider concentrating their samples or switching sample types (for example plasma) to see if that helps.

I have the following information for you regarding the kits we discussed:


ab46073:
We have no data regarding normal values observed with IL-6 and IL-4 in rat but as free circulating cytokines are rather dangerous for living animal, the normal level is probably below the detection level.


ab119548:
Unfortunately, we have not tested the rat IL-6 ELISA on normal level in rat samples. We have only tested this ELISA using samples spiked with recombinant protein.


ab100770 and ab100772:
1) What is the normal amount of rat IL4 in serum?
We tested the normal amount of IL-4 in healthy rat serum/plasma samples to be undetectable – 2 pg/ml.

2) What is the normal amount of rat IL6 in serum?
We tested the normal amount of IL-6 in healthy rat serum/plasma samples to be below the detectable limits of this ELISA. Thus, this kit may be more suitable for diseased/treated samples; however, there are some attached tips for increasing sensitivity the customer may use - see below.

3) What is the recommended dilution range for rat serum for IL4 and IL6?
We recommend a 2-fold dilution for serum/plasma samples for use with our IL-4 and IL-6 Rat ELISA kits.


Some advice for what to do if samples are reading below detection limit and how the sensitivity of the kit can be increased:


Incubate sample overnight at 4 degrees C
Increase amount of biotinylated ab (by 1.5 fold or so – too much may increase background)
Incubate biotinylated ab overnight at 4 degrees C
Increase amount of HRP-strep (by about 1.5 fold or so – too much may increase background)
Concentrate sample (using a spin column)



Please note: it’s best to try just one of these modifications at a time. Implementing too many of these changes at once may cause high background.

Thank you for your inquiry.

I heard back from the lab that you should try diluting the plasma samples because this minimizes the chances of matrix effects which can lead to inaccurate detection or non-linear responses. Matrix effects happen when some component of the sample affects immunoreactivity of the target molecule, possibly by sequestering binding sites. Auto-antibodies, binding proteins, albumin, etc. may be possible culprits, but it can of course vary depending on the sample. Sometimes certain disease states contribute to matrix effects by altering the properties of the blood (highly lipemic samples, for instance); hemolysis may also cause similar problems. For this reason, we rarely recommend running plasma or serum samples undiluted, as matrix effects are more likely to occur. The quickest and easiest way to deal with matrix effects is to dilute the sample until you obtain a linear dilution response as this will dilute out the interfering components of the sample. Our recommended dilution for rat plasma samples for this kit is 2X, of course, optimal dilution ranges are always determined by the experimenter empirically.

There may be other steps you can take to increase your detection:

Incubate sample overnight at 4 degrees C
Incubate biotinylated ab overnight at 4 degrees C
Increase amount of HRP-strep (by about 1.5 fold or so – too much may increase background)




Please note: it’s best to try just one of these modifications at a time. Implementing too many of these changes at once may cause high background.

I hope this information helps. Please contact us with any other questions.

Perdona por la espera.
Es muy posible que el motivo de la baja absorbancia observada en las placas se deba a la perdida de actividad de alguno de los componentes del kit, debido a su degradación por haberse mantenido durante tantos meses a 4C.
Siempre recomendamos adquirir los productos, especialmente los kits de actividad, cuando vayan a utilizarse. Si se almacenan durante más de un mes es aconsejable mantenerlos a -20C para evitar posibles pérdidas de actividad.
La señal del estándar para el kit de IL6 es baja, sin embargo para el kit IL1beta los valores son aceptables. En este último caso el problema es quizás el background, que provoca la perdida de sensibilidad de la recta del estándar. Adjunto un par de documentos con algunos consejos para obtener señales intensas del estándar en las placas y para disminuir el grado de background.
De todas formas, el problema más común en experimentos de determinación de IL6 e IL1beta, no tiene que ver con el ensayo en sí, sino simplemente con los bajos valores de estas citoquinas.
En suero y plasma estas se encuentran en niveles bajos normalmente. Sin embargo, hay ciertos parámetros que deben mantenerse en estos ensayos para maximizar la probabilidad de que las muestras se encuentren dentro del rango detectable del ensayo:
- Incubar muestras y estándar durante la noche a 4C.
- Incrementar la cantidad de anticuerpo de detección (en 1,5. Demasiado incremento provocaría background)
-Incrementar la cantidad de HRP Streptavidina (de nuevo en 1,5 para evitar la aparición de background)
- Concentrar las muestras (usando, por ejemplo, una columna).
Se recomienda usar cada una de estas modificaciones por separado para evitar de nuevo la aparición de background.
De todas formas dado que ambos kits se encuentran en garantía si deseáis recibir un reembolso o reemplazo no dudes en comunicármelo.
Espero que esta información sea útil. Espero tu respuesta al respecto.

Gracias por mantenerte a la espera.
Después de discutir el caso con mis compañeros, hemos comentado lo siguiente:
- Ambos kits se pidieron en Junio, si no se han utilizado hasta ahora es posible que haya habido degradación de los reactivos del mismo si no se ha almacenado a la temperatura adecuada. ¿Puedes confirmarme como se ha almacenado el kit, y el vial de estándar después de su reconstitución? ¿Estaba abierta la placa durante tiempo antes de utilizarse?
- Por el protocolo enviado entiendo que las muestras de suero no se diluyeron. Nosotros recomendamos una dilución mínima de 1/2 para muestras de suero o plasma. Si no se diluyen las muestras existe el riesgo de observar efecto matriz (este efecto ocurre cuando alguno de los compuestos de la muestra afectan a la immuno reactividad de la molécula target, enmascarando los sitios de unión). Algunos posibles causantes de ello son los anticuerpos propios, proteínas de unión, albumina etc…
El resultado es que la muestra puede dar una lectura falsa, por encima o por debajo de los valores adecuados en un test ELISA, o incluso dar una respuesta no lineal.
Incluso en algunos casos algunas enfermedades contribuyen a crear el efecto matriz alterando las propiedades de la sangre. Este efecto es difícil de predecir y de solucionar.
Por ello no solemos recomendar usar muestras de plasma o suero sin diluir, para evitar este efecto. El factor de dilución mínimo recomendado es 1/2, incluso para la detección de citoquinas poco abundantes como IL1 beta e IL6.
-También sugeriría incubar el anticuerpo por más tiempo. Al menos 2.5 horas, pero lo ideal es dejarlo actuar durante la noche para incrementar la señal.
Si te parece y estás de acuerdo te propongo ensayar los cambios sugeridos y observar si la señal aumenta. En caso contrario, ya que ambos kits están cubiertos por la garantía Abpromise, se te reemplazarían los kits o reembolsaría el importe de los mismos.
Espero que esta información sea útil. No dudes en contactarme para cualquier comentario que puedas tener al respecto.

Gracias por mandarme los cuestionarios rellenos.

¿Podrías por favor confirmarme como se llevo a cabo la preparación de la solución de HRP Streptavidina?

Recientemente se han cambiado los protocolos de algunos de nuestros kits, y antes la solución de Streptavidina-HRP estaba diluida 1000x, mientras que en la nueva versión se ha concentrado a 200X.

Si se hubiera llevado a cabo una preparación de la solución teniendo en cuenta la dilución 1/1000 esto explicaría por qué los resultados de absorbancia son tan bajos.

Si no fuera esta la causa, trataremos de encontrar otra solución en la mayor brevedad posible.

Gracias por contactarnos.

Vuelvo a pediros disculpas por las molestias causadas, y siento mucho que estos kits no hayan dado el resultado esperado.

Para poder investigar este caso, evitar que vuelva a repetirse, y desde luego estar seguros que los kits que os mandemos a modo de reemplazo están en perfectas condiciones, te agradecería que mandaras mas detalles de los resultados obtenidos.

Te pediría por favor que me reenviaras el cuestionario adjunto relleno, con cuantos más detalles mejor acerca del almacenamiento del kit, y cualquier observación que hayáis podido hacer que os haya llamado la atención al realizar el ensayo (como cambios de color).

Te agradezco también que me envíes los valores obtenidos para poder comentarlos con mis compañeros del laboratorio, y así analizar la procedencia del fallo del kit.

Agradezco mucho tu comprensión, y confío en que este problema no vuelva a repetirse en el futuro.

Thank you for your enquiry and your interest.

This kit is in stock and if you place the order today, we could deliver it by Friday the 28th September. The unit price is €490.00. I would advise you to read the datasheet as well as the on-line Protocol Booklet carefully to make sure that this productsuitsyour need.

https://www.abcam.com/ps/products/100/ab100772/documents/ab100772-IL6-Rat-ELISA-Kit-ab100772-protocol-plain-v2.pdf

Ifyou need any further assistance in the future, please do not hesitate to contact me.