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Guida alla selezione degli anticorpi secondari

La nostra guida vi aiuterà a scegliere l'anticorpo secondario più adatto alle vostre esigenze.

Specie ospite dell'anticorpo primario

L'anticorpo secondario viene prodotto contro la specie ospite utilizzata per generare l'anticorpo primario; per esempio, se si utilizza un anticorpo primario prodotto in coniglio, servirà un anticorpo secondario anti-coniglio prodotto in una specie ospite diversa dal coniglio (per es. secondario di asino anti-coniglio).

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La procedura sperimentale

Gli anticorpi secondari sono tendenzialmente disponibili in forme coniugate. Per le tecniche come ELISA o Western blot, è tendenzialmente più diffuso l'utilizzo di secondari coniugati con enzima, mentre per la citometria di flusso o l'immunofluorescenza vi è una preferenza per gli anticorpi secondari coniugati a proteine fluorescenti o coloranti come Alexa Fluor®.

Classe/sottoclasse di anticorpo

L'anticorpo secondario deve essere diretto contro l'isotipo dell'anticorpo primario.
Gli anticorpi primari policlonali sono generalmente prodotti in coniglio, capra, pecora o asino e sono generalmente isotipi IgG. L'anticorpo secondario sarà quindi generalmente un anticorpo anti-IgG H&L (a catene pesanti (Heavy) e leggere (Light)).

Gli anticorpi primari monoclonali sono solitamente prodotti in topo, coniglio e ratto. Per esempio, se l'anticorpo primario monoclonale è una IgG1 di topo, servirà un anti-topo IgG o un anti-topo IgG a frammento F(ab) meno specifico.

Classi, sottoclassi, tipi e sottotipi di immunoglobuline umane:

  • Classi o isotipi: IgG (a catene pesanti γ), IgM (μ), IgA (α), IgE (ε), IgD (δ)
  • Sottoclassi: IgG1 (a catene pesanti γ1), IgG2 (γ2), IgG3 (γ3), IgG4 (γ4); IgA1 (α1), IgA2 (α2)
  • Tipi: catena leggera κ, catena leggera λ
  • Sottotipi: λ1, λ2, λ3, λ4

Altri tipi di reattività:

  • Gli anticorpi polivalenti reagiscono con tutte le classi
  • Gli anticorpi anti-Fc o a catene pesanti (α, δ, ε, γ, e μ) reagiscono solo con catene pesanti
  • Gli anticorpi anti-F(ab) o a molecole intere reagiscono con catene pesanti e leggere indipendentemente dalla classe
  • Gli anticorpi anti-catene leggere (κ e λ) reagiscono con tutte le classi, in quanto tutte le classi utilizzano le stesse catene leggere κ e λ

Anticorpi secondari pre-assorbiti - ideali per eliminare la cross reattività tra specie

Gli anticorpi secondari pre-assorbiti sono ideali per gli esperimenti multi-colore quando si utilizzano simultaneamente diversi anticorpi primari e i loro corrispondenti anticorpi secondari. Il processo di pre-assorbimento riduce il rischio di cross-reattività tra l'anticorpo secondario e le immunoglobuline presenti sui campioni di cellule e tessuti.

Il pre-assorbimento (denominato anche cross-assorbimento) rappresenta una fase supplementare introdotta per aumentare la specificità di un anticorpo. La miscela di anticorpi secondari (contenente anticorpi secondari contro catene leggere IgG di coniglio, catene leggere IgG di pecora e catene leggere IgG di bovino, per esempio) viene fatta passare attraverso una matrice contenente sieroproteine immobilizzate provenienti da specie potenzialmente cross-reattive (in questo caso catene leggere di pecora e bovino).

Solo gli anticorpi specifici per le catene leggere IgG di coniglio passeranno attraverso la colonna, mentre gli anticorpi che interagiscono con le catene leggere IgG di pecora o bovino si legheranno e rimarranno assorbiti nella matrice. La procedura dà origine a un anticorpo secondario che riconosce in maniera specifica le catene leggere IgG di coniglio.

Anticorpi secondari a frammenti F(ab) o (Fab')2

Gli anticorpi a frammenti F(ab) e (Fab')2 eliminano il legame aspecifico tra le porzioni Fc degli anticorpi e i recettori Fc sulle cellule (come macrofagi, cellule dendritiche, neutrofili, cellule NK e cellule B) e penetrano più efficacemente nei tessuti grazie alle loro dimensioni ridotte.

Gli anticorpi frammentati, non avendo porzioni Fc, non interferiscono con la rilevazione mediata da anticorpi anti-Fc.


Alexa Fluor® is a registered trademark of Life Technologies. Alexa Fluor® dye conjugates contain(s) technology licensed to Abcam by Life Technologies.




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